Bewertung der genetischen Vielfalt und der SNP-Marker-Entwicklung im Keimplasma von Erdnüssen in Taiwan durch RAD

Jul 09, 2023

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 14495 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die Kulturerdnuss (Arachis hypogaea L.) ist eine wichtige Ölpflanze, weist jedoch eine geringe genetische Vielfalt auf. Molekulare Marker können verwendet werden, um die genetische Vielfalt verschiedener Keimplasmen zu untersuchen. In dieser Studie wurde der Ansatz der restriktionsstellenassoziierten DNA (RAD) verwendet, um 31 Akzessionen des taiwanesischen Erdnusskeimplasmas zu sequenzieren, was zur Identifizierung von insgesamt 17.610 Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs) führte. Als wir diese 31 Akzessionen nach Herkunft in zwei Untergruppen gruppierten, stellten wir fest, dass die „globale“ Untergruppe (n = 17) genetisch vielfältiger war als die „lokale“ Untergruppe (n = 14). Was botanische Sorten betrifft, so ist die Var. Die Untergruppe fastigiata wies eine größere genetische Vielfalt auf als die anderen beiden Untergruppen von var. fastigiata. vulgaris und var. Hypogaea, was darauf hindeutet, dass neuartige genetische Ressourcen in Zuchtprogramme eingeführt werden sollten, um die genetische Vielfalt zu verbessern. Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) der Genotypisierungsdaten trennte die 31 Akzessionen weitgehend nach den botanischen Sorten in drei Cluster, was mit dem PCA-Ergebnis für 282 Akzessionen übereinstimmt, die durch 14 in dieser Studie entwickelte kompetitive allelspezifische PCR-Marker (KASP) genotypisiert wurden. Die in dieser Arbeit identifizierten SNP-Marker enthüllten nicht nur die genetische Verwandtschaft und Populationsstruktur des aktuellen Keimplasmas in Taiwan, sondern bieten auch ein effizientes Werkzeug für die Züchtung und weitere genetische Anwendungen.

Die aus Südamerika stammende Kulturerdnuss (Arachis hypogaea L.) ist ein Allotetraploid (AABB, 2n = 4x = 40) und eine weltweit wichtige Hülsenfruchtpflanze. Menschen profitieren von Erdnusssamen als Nahrung und Ölquelle aufgrund ihres hohen Anteils an Proteinen und Fettsäuren1. Laut FAOSTAT (http://www.fao.org/faostat) ist die jährliche Produktion von Erdnüssen in den letzten 20 Jahren auf 53 Millionen Tonnen im Jahr 2020 gestiegen. Um der steigenden Nachfrage nach Erdnüssen angesichts der Bedrohung durch den Klimawandel gerecht zu werden, ist die Züchtung neuer Sorten eine wirksame Strategie zur Verbesserung der qualitativen und quantitativen Merkmale von Erdnüssen.

Die Erhaltung des Keimplasmas von Arachis und die Nutzung ihrer genetischen Vielfalt sind für die Züchtung der Kulturerdnuss von entscheidender Bedeutung. Derzeit sind mehrere Genbanken für ihr Arachis-Keimplasma bekannt, darunter das International Crops Research Institute for the Semi-Arid Tropics (ICRISAT), das United States Department of Agriculture (USDA) und das Oil Crops Research Institute der Chinese Academy of Agricultural Sciences ( OCRI-CAAS). Mehr als 15.000, 9.000 bzw. 8.000 Akzessionen wurden in ICRISAT, USDA und OCRI-CAAS2 erfasst. Andererseits ist das Verständnis der genetischen Vielfalt des Keimplasmas in der Hand eine Grundvoraussetzung für den Start von Zuchtprogrammen, und die Verwendung molekularer Marker ist derzeit die vorherrschende Strategie zur Bewertung der genetischen Vielfalt des Keimplasmas3. Kulturerdnüsse weisen aufgrund der jüngsten Hybridisierung ihrer beiden Vorfahren und der Selektion in Zuchtprogrammen eine geringe genetische Vielfalt auf4,5,6,7. Obwohl die geringe genetische Vielfalt kultivierter Erdnüsse die Entwicklung molekularer Marker behindert hat, war es möglich, einfache Sequenzwiederholungsmarker (SSR) zu entwickeln und zu nutzen, um die genetische Vielfalt kultivierter Erdnüsse zu bewerten8,9,10,11. Insbesondere wurden die Populationsstrukturen von 92 Akzessionen in der US Peanut Mini Core Collection und 196 großen Erdnusssorten in China durch SSR-Marker aufgedeckt12,13. Obwohl SSR-Marker häufig zur Identifizierung der genetischen Vielfalt von Erdnusspopulationen verwendet wurden, war die Populationsgröße dieser Studien aufgrund des anspruchsvollen Genotypisierungsprozesses begrenzt.

Kürzlich haben die durch Next Generation Sequencing (NGS) ermöglichten Erdnussgenomprojekte die Genforschung an kultivierten Erdnüssen revolutioniert. Bisher wurden die Genome von Arachis hypogaea L. und seinen beiden diploiden Vorfahren A. duranensis (AA) und A. ipaensis (BB) sequenziert6,7,14. Diese hochwertigen Genomsequenzen haben den Weg für die Entwicklung von Hochdurchsatz-Single-Nucleotide-Polymorphismus-Markern (SNP) geebnet, z. B. über Genotyping-by-Sequencing (GBS), die dann die molekulare Züchtung von Erdnüssen erleichtern können. Das 58-K-SNP-Array „Axiom_Arachis“, das durch Neusequenzierung von 41 Erdnuss-Akzessionen entwickelt wurde, wurde zur Identifizierung der genetischen Vielfalt über 384 Arachis-Genotypen hinweg, einschließlich der USDA Mini Core Collection und Wildarten, verwendet15, 16, während 787 Akzessionen aus der US-Erdnuss-Kernsammlung von genotypisiert wurden 14 K „Arachis_Axiom2“ SNP-Array zur Offenlegung ihrer genetischen Vielfalt17. Im Vergleich zu SNP-Arrays ist GBS eine kostengünstigere Technik, die auf der Sequenzierung des reduzierten Genoms im Zusammenhang mit Restriktionsstellen mithilfe von NGS18,19 basiert. In der Erdnussforschung wurde diese Technik bei der SNP-Entwicklung angewendet und ermöglichte die Erstellung genetischer Karten für die Kartierung quantitativer Trait-Locus (QTL) und die Analyse der Populationsstruktur20,21,22.

In Taiwan lassen sich Erdnusszuchtprogramme bis in die späten 1950er Jahre zurückverfolgen. Bisher wurden die meisten lokal entwickelten Sorten durch konventionelle Züchtung auf der Grundlage der Bewertung morphologischer Merkmale gewonnen. In solchen Zuchtprogrammen stützte sich die Elternauswahl hauptsächlich auf die Stammbauminformationen oder die Sammlungsquelle, um auf genetische Beziehungen zu schließen. Daher sollte die Nutzung verfügbarer molekularer Werkzeuge zur Charakterisierung der gegenwärtigen Erdnusssorten in Taiwan in Zukunft verbesserte Züchtungsprogramme ermöglichen. In dieser Studie haben wir den Ansatz der restriktionsstellenassoziierten DNA (RAD) durchgeführt, um 31 Genotypen zu sequenzieren – darunter aktuelle in Taiwan entwickelte Elitesorten und wichtige aus dem Ausland eingeführte Akzessionen –, um die zugrunde liegende genetische Vielfalt aufzudecken. Darüber hinaus wurden 14 kompetitive Allel-spezifische PCR (KASP)-Marker entworfen und dann zur Genotypisierung von 282 anderen Akzessionen verwendet. Insgesamt enthüllt diese Arbeit die genetische Struktur des Erdnusskeimplasmas in Taiwan durch SNP-Marker, die durch RAD-seq identifiziert wurden, und diese Marker können für eine Reihe von Anwendungen wie Sortenidentifizierung und Zuchtprogramme verwendet werden.

31 Erdnussakzessionen, die vom Taiwan Agricultural Research Institute (TARI) und der Tainan District Agricultural Research and Extension Station (Tainan DARES) verwaltet werden, wurden für den RAD-seq-Bau ausgewählt. Diese Akzessionen bestehen aus Elite-Sorten, fortgeschrittenen Zuchtlinien und „eingeführten“ alten Akzessionen, die in südamerikanischen Ländern in der Nähe des geografischen Ursprungs der Erdnuss erworben wurden (Ergänzungstabelle S1). Unter den 31 Erdnuss-Akzessionen gibt es 13 spanische, 11 Valencia-, 3 Virginia- und 4 Runner-Akzessionen. Für die Genotypisierung mittels KASP-Markern wurden 282 Erdnuss-Akzessionen vom National Plant Genetic Resources Center in TARI erhalten, darunter 66 spanische, 27 Valencia-, 49 Virginia- und 88 Runner-Akzessionen. Die in dieser Studie verwendeten Pflanzenmaterialien entsprechen den relevanten internationalen, nationalen und institutionellen Richtlinien.

Die DNA-Extraktion aller Akzessionen basierte auf jungen Blättern, die innerhalb von zwei Wochen mit der modifizierten CTAB-Methode von Sämlingen gesammelt wurden, bei der Phenol und Chloroform durch Kaliumacetat ersetzt werden, um Proteine ​​und Polysaccharide zu entfernen23. Die mit der modifizierten CTAB-Methode extrahierten DNA-Proben können direkt für die KASP-Genotypisierung verwendet werden, müssen jedoch weiter gereinigt werden, um ihre Qualität für den Aufbau der RAD-seq-Bibliothek sicherzustellen. Nachdem wir die DNA von 31 für RAD-seq verwendeten Akzessionen extrahiert hatten, verwendeten wir das QIAGEN-Kit (DNeasy Blood & Tissue Kit; Qiagen, https://www.qiagen.com/, Hilden, Deutschland), um diese DNA-Proben zu reinigen Anschließend quantifiziert und qualifiziert mit dem NanoDrop 2000-Spektrophotometer (Thermo Fisher Scientific Inc., https://www.thermofisher.com, DE, USA). Die gereinigten DNA-Proben mit (1) dem 260/280-Verhältnis von 1,8 bis 2,0, (2) dem 260/230-Verhältnis von 2,0 bis 2,4 und (3) der Konzentration ≥ 25 ng/µl wurden von weiter auf DNA-Integrität überprüft Agarosegel-Elektrophorese (1,0 %).

24 der 31 in RAD-seq verwendeten Erdnussakzessionen und 282 zusätzliche Erdnussakzessionen des Keimplasmas wurden im Herbst 2016 in TARI (Koordinaten 24° 01′ 47,5″ N 120° 41′ 47,4″ E) und 20 Pflanzen phänotypisiert jeder Akzession wurden hinsichtlich 8 quantitativer Merkmale bewertet, darunter Tage bis zur Blüte (zwischen Aussaat- und Blütedatum), Pflanzenarchitektur, Anzahl der Schoten, Ertrag (g/m2), 100-Schoten-Gewicht, 100-Samen-Gewicht, Rostbeständigkeit und Blattfleckenresistenz. Die Anfälligkeit für diese beiden Erdnusskrankheiten wurde unter natürlichen Bedingungen im Feld quantifiziert, da sich diese Krankheiten spontan im Herbst entwickeln, und die Krankheitssymptome wurden von 1 (ohne Symptome) bis 9 (sehr anfällig) bewertet24. Abhängig vom Grad der Neigung zur Vertikalität wurde die Pflanzenarchitektur mit einer Bewertung von 0 (am aufrechtsten) bis 9 (am tiefsten) bewertet.

Nach Abschluss der DNA-Extraktion, Reinigung und Qualitätskontrolle von 31 Erdnussakzessionen verwendeten wir 1,1 µg jeder hochwertigen DNA-Probe, um gemäß dem veröffentlichten Protokoll zwei RAD-seq-Bibliotheken aus 16 bzw. 15 Akzessionen zu erstellen, und PstI wurde als ausgewählt das Verdauungsenzym25. Die Next-Generation-Sequenzierung jeder Bibliothek wurde im Genomforschungszentrum der Yang-Ming-Universität unter Verwendung der Illumina Hiseq 2500-Plattform (Illumina Inc., https://www.illumina.com, CA, USA) mit 100 bp Einzelsequenzierung durchgeführt. Ende liest in zwei Spuren. Die Sequenzierungsdaten wurden beim National Center for Biotechnology Information (NCBI) unter BioProject PRJNA811600 hinterlegt. Für SNP-Aufrufe wurden Single-End-Lesevorgänge zunächst von Stacks mit dem Programm „process_radtags“26 debarcodiert. Dann verwendeten wir Burrows-Wheeler Alignment (BWA) v0.7.17-r1188 „aln“, um die Lesevorgänge jeder Akzession auf das Referenzgenom der kultivierten Erdnuss und ihrer diploiden Vorfahren auszurichten und so SNPs zu identifizieren, die in der genetischen Diversitätsanalyse und der Entwicklung von verwendet werden KASP-Marker6,14,27. Als das Genom der Kulturerdnuss veröffentlicht wurde14, waren alle in dieser Studie verwendeten KASP-Marker bereits unter Verwendung der zusammengeführten Genome zweier diploider Vorfahren der Kulturerdnuss entworfen worden6. Daher wurden identifizierte SNPs, die auf dem Genom kultivierter Erdnüsse basieren, nur für die In-silico-Analysen verwendet, die die genetische Vielfalt der 31 Akzessionen untersuchten, aber in allen Fällen war die SNP-Aufrufpipeline dieselbe. Nachdem die Ausrichtung abgeschlossen war, wurden Samtools und BCFtools für den SNP-Aufruf und die Filterung verwendet. SNPs wurden mit (1) Basisqualität ≥ 20, (2) Mapping-Qualitätsfaktor ≥ 20 und (3) Tiefe ≥ 3 beibehalten. Anschließend wurde eine angepasste Version erstellt Mithilfe eines R-Skripts wurden VCF-Dateien (Variant Call Format) erstellt, die qualifizierte SNPs umfassen, die die 31 Akzessionen unterschieden28.

Unter den SNPs, die zur Unterscheidung von 31 Erdnussakzessionen auf der Grundlage des Genoms der beiden diploiden Vorfahren verfügbar sind, haben wir 1.230 homozygote SNPs mit informativen Allelen in allen 31 Akzessionen extrahiert und dann 783 SNPs verworfen, deren Polymorphic Information Content (PIC)-Werte unter dem Gesamtdurchschnitt lagen SNPs. Schließlich wurden 29 von 477 SNPs mit einem durchschnittlichen PIC-Wert von 0,28 für die Entwicklung von KASP-Markern ausgewählt. Diese 29 mutmaßlichen SNPs mit 100 bp flankierenden Sequenzen auf beiden Seiten wurden zum Entwerfen von KASP-Primern verwendet, die dann von LGC Genomics (http://www.lgcgroup.com, Teddington, England) synthetisiert wurden. Die Validierung der KASP-Marker wurde auf dem 96-Well-Real-Time-PCR-System StepOnePlus™ (Thermo Fisher Scientific Inc., https://www.thermofisher.com, DE, USA) durchgeführt und jede 10-μl-Reaktion bestand aus 12,5 ng DNA, 0,14 μL KASP-Assay-Mix und 5 μL KASP-Master-Mix (2X). Das PCR-Protokoll wurde wie folgt durchgeführt: (1) Vorlesephase bei 30 °C für 1 Minute, (2) Haltephase bei 94 °C für 15 Minuten, (3) PCR-Phase 1 von 10 Touchdown-Zyklen unter Verwendung von 94 ° C für 20 s und 61 °C (Abnahme um 0,6 °C pro Zyklus) für 1 Minute, (4) PCR-Stufe 2 mit 26 Amplifikationszyklen bei 94 °C für 20 s und 55 °C für 1 Minute und (5) Post - Lesephase 1 Minute bei 30 °C. Nach Abschluss der PCRs wurden die Fluoreszenzsignale der Proben mit der StepOne™-Software zur Bestimmung der Genotypen analysiert.

Alle statistischen Analysen wurden in R 3.63 durchgeführt. Für jeden SNP-Marker wurden der PIC-Wert und die erwartete Heterozygotie (He) bestimmt29,30. Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) unter Verwendung phänotypischer Daten wurde mit der Funktion „PCA“ im Paket „FactoMineR“31 durchgeführt. Im Paket „poppr“ wurde die Funktion „bitwise.dist“ verwendet, um die genetischen Abstände zwischen den 31 Akzessionen zu berechnen, und diese Abstände wurden in Abhängigkeit vom Anteil der Loci berechnet, die sich zwischen Keimplasma unterscheiden32,33. Die „aboot“-Funktion wurde verwendet, um die Dendrogramme basierend auf der ungewichteten Paargruppenmethode mit arithmetischem Mittel (UPGMA) mit 1000 Bootstraps zu erstellen. Im „adegenet“-Paket wurde die PCA für SNP-Daten von 31 Akzessionen mit der Funktion „glPCA“ durchgeführt, und die Populationsstruktur von 282 Akzessionen wurde durch sukzessive K-Mittelwert-Clusterbildung und Diskriminanzanalyse der Hauptkomponenten (DAPC) unter Verwendung der „glPCA“-Funktion berücksichtigt. „find.clusters“ bzw. „dapc“-Funktion34,35. Zusätzlich zum Dendrogramm-Plot, der mit der Funktion „plot.phylo“ im Paket „ape“36 erstellt wurde, wurde die gesamte Visualisierung mit der Funktion „ggplot“ im Paket „tidyverse“37 durchgeführt.

In dieser Studie wurden 31 Erdnussakzessionen für die Durchführung von RAD-seq ausgewählt, von denen 17 Akzessionen aus dem Ausland eingeführt wurden und 14 Akzessionen in Taiwan entwickelt oder gesammelt wurden. Diese Sammlung weist wichtige agronomische Merkmale auf, darunter ertragsbezogene Merkmale, Resistenzen gegen biotischen und abiotischen Stress sowie wertvolle Merkmale auf der Ebene der genetischen Vielfalt (Ergänzungstabelle S1).

Im RAD-seq-Ansatz wurde das Sechs-Schneider-Enzym PstI für den DNA-Verdau verwendet, und so konzentrierte sich die Sequenzierung jeder Akzession auf etwa 5 % (100-bp-Verlängerungen auf beiden Seiten einer PstI-Schnittstelle, die alle 4.096 auftritt). (durchschnittlich bp) des gesamten kultivierten Erdnussgenoms (2,7 GB). Die geschätzte Sequenzierungstiefe in den 31 Akzessionen lag zwischen 4,26 (HL2) und 15,01 (Rot), und die durchschnittliche Tiefe betrug 9,47. Darüber hinaus waren mehr als 99,0 % der sequenzierten Lesevorgänge aller Proben ordnungsgemäß mit dem Referenzgenom abgeglichen. Im Vergleich zum Referenzgenom ist A. hypogaea cv. Laut Tifrunner wurden aus diesen 31 Akzessionen 1475 bis 14.471 SNPs identifiziert, mit einem Durchschnitt von 5249 SNPs, und mehr als drei Viertel dieser Polymorphismen waren homozygot. Darüber hinaus lag das Übergangs-/Transversionsverhältnis (Ts/Tv) zwischen 0,48 und 1,19 (Tabelle 1). Bezüglich der drei botanischen Sorten der Kulturerdnuss sind Akzessionen von subsp. fastigiata var. vulgaris (spanischer Typ), subsp. fastigiata var. fastigiata (Valencia-Typ) und subsp. Hypogaea var. hypogaea (Virginia/Runner-Typen) hatte insgesamt 5006, 5119 und 5905 SNPs, d. h. die Unterschiede zwischen den botanischen Sorten waren sehr gering. Interessanterweise unterschieden sich die 31 Akzessionen gut in der globalen und lokalen Sammlung und entsprachen 17 aus anderen Ländern eingeführten Genotypen bzw. 14 Genotypen aus Taiwan. Die globale Sammlung hatte einen Durchschnitt von 6071 SNPs, was höher war als der Durchschnitt von 4526 SNPs für die lokale Sammlung. Darüber hinaus führten 8 eingeführte Akzessionen, die in Südamerika nahe dem Ursprungszentrum der angebauten Erdnüsse gesammelt wurden, zu einem Durchschnitt von 7139 SNPs, was sogar mehr als die globale Sammlung ist. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die globale Keimplasmasammlung aus verschiedenen Ländern mehr Polymorphismen aufwies als die lokale Sammlung, die hauptsächlich taiwanesische Sorten enthielt.

Anschließend wurde die nächste Filterstufe durchgeführt, um nur SNPs zu behalten, die diese 31 Akzessionen unterscheiden. Infolgedessen wurden schließlich 3474 von 17.610 SNPs für die genetische Diversitätsanalyse behalten, wobei für jeden Polymorphismus eine Toleranz von höchstens 6 fehlenden Werten (20 %) berücksichtigt wurde.

Die genetische Vielfalt der 31 Erdnussakzessionen wurde durch eine Reihe von Maßen quantifiziert, darunter die erwartete Heterozygotie (He), die Hauptallelfrequenz (MAF), den polymorphen Informationsgehalt (PIC) und die genetische Distanz. Der genetische Abstand basierte auf dem bitweisen Abstand, der mit dem Abstand von Provesti identisch war und mit dem Anteil genetisch unterschiedlicher Loci zwischen 31 Akzessionen zunahm32. Der paarweise Vergleich des genetischen Abstands zwischen Akzessionen ist in der Ergänzungstabelle S2 aufgeführt. Im Durchschnitt hatten diese 31 Erdnussakzessionen einen He von 0,19, einen PIC von 0,16, einen MAF von 0,87 und einen Abstand von 0,17. Bei der Betrachtung botanischer Sorten ist das Keimplasma von subsp. fastigiata var. fastigiata hatte den größten durchschnittlichen He-, PIC- und genetischen Abstand (He = 0,18, PIC = 0,15, Abstand = 0,15) und den kleinsten MAF (0,87), verglichen mit dem des Keimplasmas von subsp. fastigiata var. vulgaris (He = 0,13, PIC = 0,11, MAF = 0,90, Abstand = 0,11) oder subsp. Hypogaea var. Hypogaea (He = 0,12, PIC = 0,10, MAF = 0,92, Abstand = 0,11) (Tabelle 2), was zeigt, dass das Keimplasma vom Typ Valencia eine höhere genetische Vielfalt aufwies als das Keimplasma vom spanischen Typ und vom Typ Virginia/Runner. In Bezug auf die Sammlungsquelle hatte die globale Sammlung einen größeren durchschnittlichen He-, PIC- und genetischen Abstand (He = 0,19, PIC = 0,15, Abstand = 0,17) und einen kleineren MAF (0,86) als die lokale Sammlung (He = 0,16, PIC = 0,14). , MAF = 0,88, Abstand = 0,14), was darauf hinweist, dass die globale Sammlung eine größere genetische Vielfalt aufwies als die lokale Sammlung. Darüber hinaus wurde der Distanzbaum für die Clusteranalyse auf Basis der UPGMA-Methode mit 1.000 Bootstraps rekonstruiert (Abb. 1). Die Ergebnisse zeigten, dass 26 der 31 Akzessionen hauptsächlich nach drei botanischen Sorten in drei Gruppen eingeteilt wurden. Keimplasma von Subsp. fastigiata var. fastigiata und subsp. fastigiata var. vulgaris wurden mit einem Abstand von 0,19 in Gruppe I und II eingeteilt, und das Keimplasma von subsp. Hypogaea var. hypogaea wurde in Gruppe III geclustert, getrennt von Gruppe I und II mit einem Abstand von 0,21. Mit Ausnahme von fünf Akzessionen wurde NS011001 (Virginia-Typ) in Gruppe I mit hauptsächlich Keimplasma vom Typ Valencia eingeteilt, während zwei Akzessionen vom Typ Valencia, Red und HL2, in Gruppe II mit hauptsächlich Keimplasma vom spanischen Typ gruppiert wurden. Interessanterweise wurden TN16 und TN17, zwei Sorten vom Typ Valencia, in Gruppe III zusammengefasst, aber von Akzessionen von subsp. getrennt. Hypogaea var. Hypogäen mit einem Abstand von 0,18.

Dendrogramm der 31 Akzessionen, erstellt nach der ungewichteten Paargruppenmethode mit arithmetischem Mittel (UPGMA). Dieses Dendrogramm basierte auf dem paarweisen genetischen Abstand mit 1000 Replikaten unter Verwendung von 3474 Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs). Die Astlänge stellt die genetische Distanz dar und die Skala befindet sich oben links in dieser Abbildung. Die Zahlen auf den Zweigen sind Bootstrap-Prozentsätze. Die Legende zeigt die Farbe von vier Markttypen, Spanish (SP), Valencia (VA), Virginia (VR), Runner (RN), und drei in diesem Diagramm gruppierte Gruppen wurden als I, II und III bezeichnet.

Um die genetische Beziehung zwischen diesen Keimplasmen weiter zu untersuchen und zu vergleichen, wurde PCA unter Verwendung genetischer Abstände zwischen den 31 Akzessionen durchgeführt, die über 3474 SNPs berechnet wurden. Das PCA-Ergebnis zeigte, dass die ersten drei Hauptkomponenten (PC1, PC2 und PC3) 24,2 %, 20,8 % bzw. 8,2 % der Varianz erklärten, was insgesamt 53,2 % der gesamten genetischen Distanzvarianz ausmacht (Abb. 2). Die Streudiagramme der PCs ließen jedoch darauf schließen, dass PCA auf der Grundlage genomischer Daten die 31 Akzessionen gut unterschied. In den drei Biplots von PC1/PC2, PC2/PC3 und PC1/PC3 basierend auf PCA unter Verwendung von 3474 SNPs gelang es dem ersten Paar, 31 Akzessionen in drei klare Gruppen zu unterscheiden, hauptsächlich nach drei botanischen Sorten, Subsp. fastigiata var. vulgaris (spanischer Typ), subsp. fastigiata var. fastigiata (Valencia-Typ) und subsp. Hypogaea var. Hypogaea (Virginia/Runner-Typen), während das zweite und dritte Paar in der Lage waren, TN16 und TN17 aus drei Clustern zu trennen, die vom ersten Paar zugewiesen wurden (Abb. 2). Darüber hinaus zeigte das mit den drei PCs erstellte 3D-Streudiagramm eine Beziehung von 31 Akzessionen, die mit den drei PC-Biplots kompatibel waren (Abb. 2).

Hauptkomponentenanalyse (PCA) der 31 Akzessionen basierend auf 3474 Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs). Die 31 Beitritte wurden durch 4 Markttypen visualisiert: Spanisch (SP), Valencia (VA), Virginia (VR), Runner (RN).

In dieser Studie bestand eines unserer Ziele darin, eine Reihe nicht gelbasierter SNP-Marker zu entwickeln, die zur Untersuchung der genetischen Struktur innerhalb der im National Plant Genetic Resources Center von TARI aufbewahrten Keimplasma-Sammlung genutzt werden könnten. Als dieses Projekt startete, war das Genom der kultivierten Erdnuss noch nicht veröffentlicht. Daher stützte sich die Entwicklung von SNP-Markern für die KASP-Genotypisierung auf die beiden diploiden Vorfahren der kultivierten Erdnuss6. Beachten Sie, dass die hier verwendete SNP-Aufrufpipeline dieselbe war wie die, die SNPs aus dem kultivierten Erdnussgenom identifizierte, um die genetische Vielfalt der 31 Akzessionen zu bewerten. Von den SNPs, die durch die Kartierung auf die beiden diploiden Ahnengenome identifiziert wurden, waren bei 1230 beide Allele in den 31 Akzessionen vertreten und erfüllten gleichzeitig die Bedingung, homozygot zu sein und keine fehlenden Daten darin zu haben. 477 dieser SNPs wurden behalten, weil ihr PIC-Wert höher war als der Durchschnitt der 1230 homozygoten SNPs (Ergänzungstabelle S3). Gleichzeitig führten wir im Herbst 2016 ein Feldexperiment durch, um 8 agronomisch quantitative Merkmale für 24 der 31 in RAD-seq verwendeten Akzessionen und die anderen 282 Erdnussakzessionen des TARI-Keimplasmas zu bewerten, darunter 66 spanische, 27 valencianische und 49 Zugänge vom Typ Virginia und 88 Runner. Die zusammenfassenden Statistiken zeigten, dass Akzessionen von subsp. Fastigiata hatte Merkmale einer frühen Reife, mehr Schoten und einen höheren Ertrag, aber etwas weniger Fleckenresistenz im Vergleich zu Akzessionen von Subsp. Hypogäen (Ergänzungstabelle S4). Die phänotypischen Daten aus dieser Studie ermöglichten es uns, die Fähigkeit genotypischer und phänotypischer Daten zu vergleichen, genetische Beziehungen zwischen Erdnussakzessionen zu identifizieren (Ergänzungstabelle S5).

Wir führten eine PCA separat für die genotypischen Daten von 29 von 477 SNPs mit einem durchschnittlichen PIC-Wert von 0,28 und für die phänotypischen Daten (8 agronomische Merkmale aus 24 der 31 Akzessionen basierend auf Feldexperimenten) durch. Für PCA basierend auf 29 SNPs wurden 31 Akzessionen nach ihren botanischen Sorten in drei Cluster eingeteilt (Abb. 3). Darüber hinaus machten die ersten drei PCs mit Eigenwerten zwischen 0,49 und 1,79 67,8 % der Gesamtvarianz aus (Ergänzungstabelle S6). Die drei wichtigsten SNP-Marker mit dem größten Beitrag zu drei PCs waren wie folgt: (1) PC1: B02_105774702, B04_1643180, B09_70140267 und B09_141920571, (2) PC2: A01_9265671, A02_65802170 und A01_90269752 und (3) PC3: B05_133797191, A09_45155599 und A01_90916564 (Ergänzungstabelle S6). Andererseits machten PC1, PC2 und PC3 in der PCA, die auf den phänotypischen Daten von 8 agronomischen Merkmalen beruhten, 73,0 % der gesamten phänotypischen Varianz aus, und diese PCs hatten Eigenwerte im Bereich von 1,46 bis 2,41 (Ergänzungstabelle S7). Die drei wichtigsten Merkmale, die am meisten zu den drei PCs beitrugen, waren folgende: (1) PC1: Ertrag, Anzahl der Schoten und Tage bis zur Blüte, (2) PC2: Pflanzenarchitektur, Anzahl der Schoten und 100 Samengewicht und (3) PC3: Blattfleckengrad, Rostgrad und 100-Schoten-Gewicht (Ergänzungstabelle S7). Im Gegensatz zum PCA-Ergebnis unter Verwendung von 29 SNPs lieferte für die drei Biplots und das 3D-Streudiagramm der PCA, abhängig von den phänotypischen Daten, keine nennenswerten Hinweise auf die Struktur innerhalb der 24 der 31 Akzessionen (ergänzende Abbildung S1), was darauf hindeutet, dass 29 SNPs dazu in der Lage waren um 31 Akzessionen besser zu unterscheiden als 8 agronomische Merkmale. Diese 29 SNPs wurden daher als KASP-Marker konzipiert.

Hauptkomponentenanalyse (PCA) der 31 Akzessionen basierend auf 29 Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs). 31 Akzessionen wurden nach 4 Markttypen visualisiert: Spanisch (SP), Valencia (VA), Virginia (VR), Runner (RN).

Um diese 29 KASP-Marker zu validieren, wurden 282 Akzessionen des TARI-Keimplasmas mit 66 spanischen, 27 Valencia-, 49 Virginia- und 88 Runner-Typ-Akzessionen genotypisiert. 14 von 29 KASP-Markern zeigten im ersten Validierungsprozess ein stabiles und erkennbares Genotypisierungsergebnis. Die Populationsstrukturanalyse von 282 Akzessionen wurde dann durch PCA bestimmt, wobei entweder genetische Abstände zwischen diesen 282 Akzessionen verwendet wurden, die anhand der KASP-Marker-Genotypisierungsdaten (Ergänzungstabelle S8) berechnet wurden, oder die phänotypischen Daten aus dem Feldexperiment im Herbst 2016 basierend auf 8 agronomischen Daten Züge. Die PCA-Biplots zeigten, dass die PCA, die die genotypischen Daten verwendete, eine bessere Leistung erbrachte als diejenige, die die phänotypischen Daten zur Unterscheidung von 282 Akzessionen verwendete. Für die auf Genomdaten basierenden Streudiagramme erklärten PC1 und PC2 36,9 % bzw. 18,3 % der Varianz der Genotypisierungsdaten und teilten diese Akzessionen in drei Gruppen nach drei botanischen Sorten ein (subsp. fastigiata var. vulgaris, subsp. fastigiata var. vulgaris). fastigiata und subsp. hypogaea var. hypogaea). Darüber hinaus waren die KASP-Marker, die am meisten zur Varianz von PC1 und PC2 beitrugen, B04_84804214, B09_6670331, A01_9265671, A02_65802170 und A05_80673567, A01_90916564 (Ergänzungstabelle S9). Andererseits machten die ersten beiden PCA aus der PCA, die phänotypische Daten verwendeten, 28,4 % bzw. 24,1 % der phänotypischen Variation aus und trennten diese Akzessionen nur recht grob in zwei Gruppen (subsp. fastigiata var. vulgaris/var. fastigiata und subsp. fastigiata var. vulgaris/var. fastigiata). hypogaea var. hypogaea). Die meisten Akzessionen vom spanischen und valencianischen Typ waren anhand phänotypischer Daten schwer zu unterscheiden, und die Gruppierung zwischen spanischen/Valencia- und Virginia/Runner-Akzessionen war weniger klar als im PCA-Ergebnis basierend auf Genotypisierungsdaten (Abb. 4). Die Hauptmerkmale, die für die Varianz von PC1 und PC2 verantwortlich sind, waren die Tage bis zur Blüte, die Menge an Blattflecken, der Ertrag und die Anzahl der Schoten (Ergänzungstabelle S10).

Hauptkomponentenanalyse (PCA) von 282 Akzessionen basierend auf Genotypisierungsdaten von 14 kompetitiven allelspezifischen PCR (KASP) und phänotypischen Daten. 282 Akzessionen wurden nach 4 Markttypen visualisiert: Spanisch (SP), Valencia (VA), Virginia (VR), Runner (RN).

Um die Bevölkerungsstruktur innerhalb der 282 Akzessionen weiter zu identifizieren, wurde eine Diskriminanzanalyse der Hauptkomponenten (DAPC) basierend auf einer zunehmenden Anzahl von Clustern (K) durchgeführt, die durch aufeinanderfolgende K-Mittel zugewiesen wurden. Bei einem solchen Ansatz wurde das Bayes'sche Informationskriterium (BIC) zur Bewertung der Modellrelevanz verwendet, und das Ergebnis zeigte, dass es am besten ist, K-Werte von mindestens 3 für die Clusterung der 282 Akzessionen zu verwenden (ergänzende Abbildung S2). In ähnlicher Weise wurde DAPC für 2, 3 und 4 Cluster durchgeführt, um die Bevölkerungsstruktur von 282 Akzessionen zu untersuchen. Bei K = 2 entsprachen die Cluster Akzessionen vom Typ Spanish/Valencia und Virginia/Runner. Bei K = 3 entsprachen die drei Gruppen weitgehend Spanish, Valencia und Virginia/Runner. Bei K = 4 war der allgemeine Gruppierungstrend ähnlich wie bei K = 3, wies jedoch eine Mischung aus Akzessionen der drei botanischen Sorten auf, die der vierten Gruppe zugeordnet wurden (ergänzende Abbildung S3). Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass unsere KASP-Marker wirksam zur Identifizierung der Populationsstruktur des Erdnusskeimplasmas entsprechend den botanischen Sorten geeignet sind und sogar den ähnlichen genetischen Hintergrund veranschaulichen können, der durch Akzessionen entsteht, die einer Mischung botanischer Sorten entsprechen.

Molekulare Marker sind in vielen Aspekten der Pflanzengenetik und -züchtung von Bedeutung, einschließlich der Sortenidentifizierung, des Positionsklonens und der Erforschung der genetischen Vielfalt und Populationsstruktur im Keimplasma. Die Entwicklung molekularer Marker in der Kulturerdnuss war aufgrund ihrer geringen genetischen Vielfalt und der hohen Sequenzähnlichkeit zwischen ihren beiden diploiden Genomen eine Herausforderung38. Die Zusammenstellung der Genome kultivierter Erdnüsse und ihrer diploiden Vorfahren mithilfe von NGS-Ansätzen hat die Genomforschung in der Erdnussgemeinschaft erheblich vorangetrieben. Insbesondere die Sequenzierung mit reduzierter Repräsentation wie GBS und RAD-seq wurde in der Erdnussforschung häufig eingesetzt20,21,22. In dieser Studie wurde der RAD-seq-Ansatz verwendet, um 31 Akzessionen von taiwanesischem Keimplasma zu sequenzieren, zerlegt in eine „globale“ Untergruppe mit 17 „eingeführten“ Akzessionen und eine „lokale“ Untergruppe mit 14 taiwanesischen Akzessionen, von denen 12 aktuelle Elite-Sorten sind, 1 Dabei handelt es sich um eine Landrasse und bei 1 um eine fortgeschrittene Zuchtlinie. Die globale Untergruppe hatte eine höhere durchschnittliche Anzahl an SNPs als die lokale Untergruppe, was darauf hindeutet, dass das Keimplasma aus dem Ausland mehr Polymorphismen aufwies als das lokale Keimplasma, und dies kann durch die Tatsache erklärt werden, dass die Akzessionen der globalen Untergruppe hauptsächlich aus Nord- und Südamerika eingeführt wurden Südamerika umfasst die Herkunftsregion der domestizierten Kulturerdnüsse, was die Vorstellung stützt, dass die Herkunft domestizierter Nutzpflanzen eine große Vielfalt aufweist39. Dieses Ergebnis war kompatibel mit früheren Arbeiten an Sojabohnen und Sorghum, die auf SSR-Markern basierten. Tatsächlich fanden Iquira et al.40 und Ghebru et al.41 beide heraus, dass die Keimplasmasammlung mit Akzessionen, die größtenteils vom Ursprung ihrer Kulturpflanze stammten, mehr einzigartige Allele aufwies als die andere Sammlung mit Akzessionen aus Regionen, die weit vom Ursprung entfernt waren.

Die genetische Vielfalt dieser 31 Akzessionen wurde dann mithilfe verschiedener Ansätze auf der Grundlage von 3474 SNPs untersucht. Insgesamt hatte dieses Panel einen durchschnittlichen PIC, erwarteten He, MAF und genetischen Abstand von 0,16, 0,19, 0,87 bzw. 0,17 (Tabelle 2), was mit früheren Untersuchungen unter Verwendung der SNP-Genotypisierung übereinstimmte42,43,44. Beachten Sie, dass der PIC-Wert den Grad der Polymorphie eines Markers angibt. Marker gelten entsprechend ihren PIC-Werten als sehr informativ (größer als 0,5), einigermaßen informativ (0,25–0,5) und nur geringfügig informativ (kleiner als 0,25)29. Der durchschnittliche PIC von 0,16 aus diesen 31 Akzessionen fiel in diese letzte Klasse, während 32 % der identifizierten SNPs der einigermaßen informativen Klasse entsprachen. In Studien von drei anderen Keimplasmasammlungen, die mit 48 K- und 58 K-SNP-Arrays genotypisiert wurden, hatten zwei Sammlungen, die Akzessionen von drei botanischen Sorten wie diese Studie umfassten, einen mittleren PIC-Wert von 0,1942,44, und die dritte Keimplasmasammlung enthielt nur Akzessionen von zwei botanischen Sorten Sorten hatten einen mittleren PIC-Wert von 0,0843, was bedeutet, dass das in dieser Studie ausgewählte Keimplasma-Panel aus 31 Akzessionen trotz einer kleineren Stichprobengröße im Vergleich zu denen in diesen drei Studien einen hohen Anteil der gesamten genetischen Vielfalt bewahrt.

Tabelle 2 konzentrierte sich auf Teilmengen, die mit dem Ursprung unseres Keimplasmas in Zusammenhang stehen, und zeigte, dass die globale Teilmenge (n = 17) einen höheren durchschnittlichen PIC-Wert (0,15) aufwies als die lokale Teilmenge (0,14 mit n = 14). In ähnlicher Weise waren das durchschnittliche He und die genetische Distanz der globalen Teilmenge (He = 0,19, Distanz = 0,17) größer als die der lokalen Teilmenge (He = 0,16, Distanz = 0,14), was darauf hindeutet, dass die globale Teilmenge eine größere genetische Vielfalt aufwies als die lokale Teilmenge. Während diese 31 Akzessionen in drei botanische Sorten unterteilt wurden, wurden Akzessionen von subsp. fastigiata var. fastigiata (Valencia-Typ) hatte im Durchschnitt einen größeren He- (0,18), PIC- (0,15) und genetischen Abstand (0,15) als subsp. fastigiata var. vulgaris (spanischer Typ, He = 0,13, PIC = 0,11, Abstand = 0,11) und subsp. Hypogaea var. Hypogaea (Virginia/Runner-Typen, He = 0,12, PIC = 0,10, Distanz = 0,11). Bei den 31 Akzessionen stammten 11 Genotypen von subsp. fastigiata var. Fastigiata einschließlich 7 eingeführter Akzessionen, 3 Sorten und 1 Landrasse; Insbesondere stammten fünf von sieben eingeführten Beitritten aus Ländern in Südamerika, darunter Brasilien, Uruguay, Peru und Venezuela. Die kultivierte Erdnuss stammt ursprünglich aus Südamerika45, daher wird erwartet, dass Genotypen von subsp. fastigiata var. fastigiata weisen eine größere genetische Vielfalt auf als die Genotypen von subsp. fastigiata var. vulgaris und subsp. Hypogaea var. Hypogaea, aus der die meisten Sorten in Taiwan bestehen. Es wird auch erwartet, dass sie eine größere Diversität aufweisen als die in dieser Studie eingeführten Akzessionen, die aus Regionen stammen, die außerhalb des Ursprungszentrums der angebauten Erdnüsse liegen.

Genetische Beziehungen zwischen den 31 Akzessionen wurden unter Verwendung des paarweisen genetischen Abstands für die Konstruktion des Dendrogramms und der PCA untersucht (Ergänzungstabelle S2). Im Allgemeinen wurden diese 31 Akzessionen entsprechend den drei botanischen Sorten in drei Cluster eingeteilt. Gruppe I und Gruppe II mit hauptsächlich subsp. fastigiata var. fastigiata und subsp. fastigiata var. vulgaris waren durch einen genetischen Abstand von 0,19 getrennt, und Gruppe III war von Gruppe I/II durch einen genetischen Abstand von 0,21 getrennt (Abb. 1). Diese Ergebnisse zeigten, dass Gruppe I und Gruppe II enger miteinander verwandt waren als mit Gruppe III, was mit der botanischen Klassifizierung und anderen Studien mit größeren Stichprobengrößen übereinstimmt12,16,22.

Dieses Dendrogramm-Ergebnis deutete auch darauf hin, dass die lokalen Sorten in Taiwan aufgrund der übermäßigen Nutzung begrenzter genetischer Ressourcen als Zuchtmaterial, insbesondere Genotypen des Keimplasmas vom spanischen Typ, unter einer geringen genetischen Vielfalt leiden könnten (Abb. 1). In der Hauptgruppe innerhalb der Gruppe II gab es 9 Akzessionen aus der lokalen Untergruppe mit 8 Sorten und 1 Landrasse. Dem Stammbaum dieser 8 Sorten zufolge waren viele von ihnen genetisch ähnlich zu TNS9. TNS9 wurde 1966 durch reine Linienselektion unter Verwendung der eingeführten Linie „Giay“ aus Vietnam entwickelt und diese Sorte dominierte in den 1980er Jahren aufgrund ihres günstigen Geschmacks nach dem Rösten mehr als 80 % der Erdnussproduktion in Taiwan. Diese Sorte wurde auch in großem Umfang in Erdnusszuchtprogrammen in Taiwan genutzt, beispielsweise bei der Entwicklung von TNG10, HL1, HL2, TN14 und TN18, die alle durch die Hybridisierungszüchtungsmethode hergestellt wurden. Insbesondere wurde TNS9 direkt als Elternteil von HL1 ausgewählt und trug indirekt zum genetischen Hintergrund der anderen vier Sorten bei, indem es als Elternteil fortgeschrittener Zuchtlinien ausgewählt wurde, die in den Zuchtprogrammen dieser drei Sorten verwendet wurden. Basierend auf Stammbauminformationen wird daher angenommen, dass HL2, eine Sorte vom Typ Valencia, in die Gruppe mit überwiegend spanischem Keimplasma eingeordnet wurde. Andererseits sind TN16 und TN17, die beide reich an Anthocyanen auf Cyanidinbasis auf der Samenschale sind, zwei taiwanesische Sorten vom Typ Valencia, die aus derselben biparentalen Zuchtpopulation durch Hybridisierung zweier in Zentraltaiwan gesammelter Landrassen stammen. Das Dendrogramm-Ergebnis zeigte, dass TN16 und TN17 in Gruppe III geclustert waren; Darüber hinaus waren sie offensichtlich von den anderen Akzessionen dieser Gruppe getrennt. Daher waren diese beiden Sorten nicht eng mit den drei Gruppen verwandt, die die anderen 29 Akzessionen enthielten, was darauf hindeutet, dass potenziell lokal gesammelte genetische Ressourcen das aktuelle taiwanesische Keimplasma immer noch diversifizieren können. Das gleiche Ergebnis der Clusterbildung wurde auch bei Verwendung von PCA basierend auf der genetischen Distanz gefunden (Abb. 2).

Um die genetische Vielfalt über die 31 Akzessionen hinaus zu verstehen, wurden 14 KASP-Marker, die von RAD-seq-Daten von 31 Akzessionen entwickelt wurden, verwendet, um die Populationsstruktur von 282 Erdnussakzessionen aus dem Keimplasma-Konservierungszentrum in TARI zu bewerten. Andererseits betrachteten wir phänotypische Daten auch als alternatives Instrument zur Bewertung der Populationsstruktur; Konkret wurden im Feldversuch im Herbst 2016 8 agronomische quantitative Merkmale anhand von 306 Akzessionen bewertet, darunter 282 Erdnussakzessionen für die KASP-Markervalidierung und 24 von 31 Akzessionen, die in RAD-seq verwendet wurden.

Die Phänotypisierungsergebnisse stimmten mit ähnlichen Feldversuchen überein, die in Indien und der Türkei durchgeführt wurden und bei denen die Subsp. fastigiata und subsp. Hypogäen in zwei Gruppen46,47. Ähnlich wie bei den Ergebnissen zweier früherer Studien stellten wir fest, dass die Subsp. Fastigiata-Akzessionen in Taiwan wiesen frühe Reifemerkmale auf. Unsere Arbeit zeigte jedoch, dass die Subsp. Fastigiata-Akzessionen haben mehr Hülsen als zuvor berichtet, ihre ertragsbezogenen Merkmale deuteten darauf hin, dass die Subsp. Fastigiata-Akzessionen liefern höhere Erträge als Subsp. Hypogäen-Akzessionen in Taiwan (Ergänzungstabelle S4). Dieses Ergebnis kann durch das Klima in Taiwan erklärt werden, das die Erdnusszuchtstrategie beeinflusst. In Bezug auf die Klimazonen ist Taiwan in den nördlichen Teil, der zur subtropischen Klimazone gehört, und den südlichen Teil, der zur tropischen Klimazone gehört, unterteilt, sodass den Landwirten jährlich zwei Anbausaisonen zur Verfügung stehen. Allerdings können die „Pflaumenregen“-Saison zwischen Mitte Mai und Mitte Juni und Taifune zwischen Juni und Oktober den Erdnussertrag am Ende der ersten Erntesaison bzw. zu Beginn der zweiten Erntesaison ernsthaft schädigen. Daher haben taiwanesische Erdnusszüchter Erdnussakzessionen mit frühen Reifemerkmalen, insbesondere Erdnüsse vom spanischen Typ, als Zuchtmaterial ausgewählt, was das Ergebnis in der Ergänzungstabelle S4 widerspiegelt, dass Akzessionen vom spanischen Typ mehr Schoten aufweisen als Akzessionen von drei anderen Markttypen. Bei den auf phänotypischen Daten basierenden PCA-Analysen konnten die 24 in RAD-seq verwendeten Akzessionen nicht unterschieden werden, und die 282 Akzessionen, die für die KASP-Validierung verwendet wurden, wurden hauptsächlich nach der Subsp in zwei Cluster gruppiert. fastigiata und subsp. Hypogäen (Abb. 4, ergänzende Abb. S1). In der PCA der 282 Akzessionen waren die Merkmale, die in PC1 und PC2 die wichtigste Rolle spielten, die Tage bis zur Blüte, der Grad der Blattfleckenresistenz, der Ertrag und die Anzahl der Schoten, was mit Merkmalen übereinstimmt, die einen signifikanten Unterschied zwischen zwei Erdnuss-Unterarten aufweisen (Ergänzungstabellen S4). , S10).

Während wir diese KASP-Marker anhand von 282 Genotypen validierten, zeigten die PCA-Ergebnisse, dass diese Genotypen entsprechend drei botanischen Sorten deutlich in drei Gruppen unterteilt waren (Abb. 4). Diese Schlussfolgerung wurde auch durch K-Means-Clustering gestützt, insbesondere mit der Wahl K = 3; Über diesen Wert hinaus verbesserte sich der BIC-Wert nicht wesentlich (ergänzende Abbildung S2). Darüber hinaus unterschieden diese KASP-Marker deutlich Subsp. fastigiata und subsp. Hypogaea-Akzessionen bei K = 2 und dann getrennte Var. fastigiata und var. vulgaris aus derselben Unterart fastigiata bei K = 3, was mit früheren Arbeiten kompatibel war22. Bei der Einstellung K = 4 enthielt die zusätzliche Gruppe jedoch eine Mischung aus vier marktüblichen Keimplasmatypen, die zu allen drei botanischen Sorten gehörten, was darauf hindeutet, dass zwischen diesen Akzessionen möglicherweise ein Austausch des genetischen Hintergrunds stattgefunden hat. Dieses Ergebnis eines vierten Clusters, das keinen Unterarten oder Markttypen entspricht, wurde auch in anderen Arbeiten berichtet12,42 und kann auf Phänotypisierungsschwierigkeiten zurückzuführen sein48,49. In beiden Sätzen, die 31 bzw. 282 Akzessionen enthielten, wurde PCA verwendet, um die Wirksamkeit von molekularen Markern und phänotypischen Daten mit Clusterproben zu vergleichen, und es wurde gezeigt, dass auf molekularen Markern basierende PCA reproduzierbarere und zufriedenstellendere Ergebnisse liefert als auf phänotypischen Daten basierende PCA (Abb. 2, 4, ergänzende Abb. S1).

Insgesamt wurde die genetische Vielfalt und Beziehung zwischen Erdnusskeimplasma in Taiwan durch SNPs aufgedeckt, die durch den RAD-Ansatz identifiziert wurden. Unsere Analysen legen nahe, dass man die genetische Vielfalt durch die Einführung eines neuen Keimplasmas erweitern sollte, um genetische Anfälligkeit zu verhindern. Darüber hinaus könnten die hier erfolgreich entwickelten KASP-Marker nützliche Werkzeuge zur Identifizierung der Populationsstruktur anderer Erdnuss-Keimplasmasammlungen oder zur Durchführung weiterer genetischer Studien im Zusammenhang mit der Zucht sein.

Die Sequenzierungsdaten von 31 Akzessionen, die in dieser Studie erstellt wurden, wurden beim NCBI BioProject PRJNA811600 hinterlegt. Alle Codes zu diesem Projekt sind auf der Github-Site https://github.com/ymhsu/ahdivertwn verfügbar.

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Wir danken OC Martin, T. Blein und KH Chen für die Diskussionen. Die Autoren danken außerdem Dr. KY Chen von der National Taiwan University für die Bereitstellung von Ressourcen und CY Liu für die Anleitung bei der Vorbereitung von RAD-seq-Bibliotheken.

Diese Forschung wurde durch Mittel des Council of Agriculture of Taiwan (Projekt-ID: 105AS-9.3.1-CI-C3 und 106AS-8.2.1-CI-C3) unterstützt. Die Arbeit von YM. Hsu wurde durch ein PhD-Stipendium des Bildungsministeriums (Taiwan) und der Université Paris-Sud/Saclay unterstützt. IPS2 profitiert von der Unterstützung von Saclay Plant Science-SPS (ANR-17-EUR-0007).

Universität Paris-Saclay, CNRS, INRAE, Univ. Evry, Institut für Pflanzenwissenschaften Paris-Saclay (IPS2), 91405, Orsay, Frankreich

Yu-Ming Hsu

Universität Paris Cité, CNRS, INRAE, Institut für Pflanzenwissenschaften Paris-Saclay (IPS2), 91405, Orsay, Frankreich

Yu-Ming Hsu

Abteilung für Pflanzenwissenschaften, Taiwan Agricultural Research Institute, Taichung, 413008, Taiwan, Republik China

Yu-Ming Hsu, Shin-Ruei Lee, Hsiang Fang, Wei-Chia Hung und Hung-Yu Dai

Abteilung für Pflanzenverbesserung, landwirtschaftliche Forschungs- und Erweiterungsstation des Bezirks Tainan, Tainan, 71246, Taiwan, Republik China

Sheng-Shan Wang

Abteilung für Agronomie, National Chiayi University, Chiayi, 60004, Taiwan, Republik China

Yu-Chien Tseng & Hsin-I. Kuo

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HYD und SSW haben die Studie konzipiert und die Finanzierung eingeworben. YMH entwarf die Bioinformatik- und Datenanalyse-Pipeline und schrieb das Manuskript. SRL, HF, WCH und HIK führten die Experimente durch. YCT betreute den Studenten. Alle Autoren haben zur Überarbeitung des Manuskripts beigetragen.

Korrespondenz mit Hung-Yu Dai.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Hsu, YM., Wang, SS., Tseng, YC. et al. Bewertung der genetischen Vielfalt und der SNP-Marker-Entwicklung im Keimplasma von Erdnüssen in Taiwan durch RAD-seq. Sci Rep 12, 14495 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-18737-0

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Eingegangen: 17. März 2022

Angenommen: 18. August 2022

Veröffentlicht: 25. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-18737-0

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