Anwendung von Nickel-Chitosan-Nanokonjugat als Antimykotikum zur Bekämpfung der Fusariumfäule von Weizen

Jun 11, 2023

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 14518 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Agrarforscher versuchen ständig, ein potenzielles Biomolekül mit antimykotischen Eigenschaften zu entwickeln, um den Einsatz synthetischer Fungizide auf landwirtschaftlichen Feldern zu ersetzen. Die häufig durch Fusarium solani verursachte Fäulniskrankheit führte jedes Jahr zu schweren Verlusten bei der Weizenernte. Chitosan und seine metallischen Nanoderivate besitzen eine antimykotische Breitbandwirkung. Unsere interdisziplinäre Studie befasst sich mit der Anwendung von Nickel-Chitosan-Nanokonjugat (NiCNC) gegen Fusariumfäule von Weizen im Vergleich zu Chitosan-Nanopartikeln (CNPs) und dem kommerziellen Fungizid Mancozeb. CNPs und NiCNC wurden auf Basis von UV-Vis-Spektrophotometrie, HR-TEM, FESEM, EDXS und FT-IR charakterisiert. Sowohl CNPs als auch NiCNC erwiesen sich als wirksam gegen das Pilzwachstum, wobei NiCNC bei 0,04 mg/ml eine vollständige Beendigung von F. solani in einem geeigneten Medium zeigte. Die Ultrastrukturanalyse von mit NiCNC behandelten F. solani-Konidien ergab deutliche Schäden und Störungen der Membranoberfläche. Eine fluoreszenzmikroskopische Untersuchung ergab die Entstehung von oxidativem Stress im Pilzsystem bei NiCNC-Exposition. Darüber hinaus zeigte NiCNC eine Verringerung des Auftretens von Fäulniskrankheiten um 83,33 % der Weizensämlinge, was durch die Beobachtung anatomischer Abschnitte des Stängels weiter bestätigt wurde. Die NiCNC-Anwendung hilft dem Sämling, die schädlichen Auswirkungen von Krankheitserregern zu überwinden, was anhand von Stressindizes-Attributen bewertet wurde.

Für die Agrarwissenschaftler war es über Jahre hinweg eine große Herausforderung, Pilzkrankheiten zu bekämpfen, die einen großen Teil wirtschaftlich wichtiger Nahrungspflanzen zerstören. Pilzpathogene verursachten schwere Verluste in der weltweiten Agrarproduktion1,2,3,4. Ein solcher schädlicher Krankheitserreger ist Fusarium spp. das bei einer Vielzahl von Pflanzenarten zu Infektionen führt. Hauptsächlich verursacht es Krankheiten wie Welke, Kopffäule, Fuß- und Wurzelfäule5,6. Fuß- und Wurzelfäule von Weizen (Triticum aestivum L.), die in der Nähe der Wurzelstammbasis auftritt, ist eine der häufigsten Pilzkrankheiten, die in den wichtigsten Weizenanbaugebieten Europas, Asiens, Nordamerikas und Australiens zu enormen Ernteverlusten führt7,8, 9,10. Mehrere Arten von Fusarium gelten als phytopathogene Pilze gegen kleinkörnige Getreidesorten wie Weizen, Gerste, Hafer usw.11. Den im Jahr 202012 veröffentlichten Berichten zufolge gibt es fast neun verschiedene Arten von Fusarium, die Fäulniskrankheiten bei Weizen verursachen. Die Art Fusarium solani ist einer der am häufigsten vorkommenden Fäule verursachenden Pilze in wirtschaftlich wichtigen Kulturpflanzen wie Weizen13,14. Es wird berichtet, dass Fuß- und Wurzelfäule von Weizen hauptsächlich durch Fusarium solani und Fusarium oxysporum verursacht werden15,16. Epidemien der Fusariumfäule führen jedes Jahr zu schweren Ernteausfällen, da die Getreideproduktion erheblich zurückgeht und die Qualität beeinträchtigt wird17. Die Fäulniskrankheit befällt den basalen Teil der Pflanze und blockiert den Wasser- und Nährstofffluss zu den Blättern. Bei einer Infektion produzieren mehrere Fusarium-Arten gesundheitsgefährdende Sekundärmetaboliten, sogenannte Mykotoxine, die sich in den Pflanzen ansammeln und deren Aufnahme für den menschlichen Organismus tödlich sein kann18. Die Art Fusarium solani ist der größte Produzent von T-2-Toxin (T = Trichothecene), einem Vorläufer von Neosolaniol, einer neurotoxischen Verbindung19. Daher ist die Bekämpfung der Fusarium solani-Fäule in wichtigen wirtschaftlich wichtigen Kulturpflanzen von entscheidender Bedeutung für die Minimierung des Ertragsverlusts.

In den letzten Jahren haben Wissenschaftler vielseitige Biomoleküle wie Nanopartikel (NPs) oder Nanokonjugate (NCs) entwickelt und zur Bekämpfung von Pilzinfektionen eingesetzt20. Mehrere Forscher haben Chitosan für die Synthese von NPs oder NCs aufgrund seiner Biokompatibilität, seiner größeren Permeabilität in biologische Membranen, seiner Kosteneffizienz, seiner geringen Toxizität und seiner Umweltfreundlichkeit verwendet21,22. Wissenschaftler sind aufgrund seiner polykationischen Natur, die an verschiedene negativ geladene Zellkomponenten von Pilzpathogenen binden kann, bereits zu dem Schluss gekommen, dass Chitosan ein Antimykotikum ist23,24,25. Die Umwandlung von Chitosan in Chitosan-Nanopartikel (CNPs) führt aufgrund seiner vergrößerten Oberfläche und höheren Einkapselungseffizienz zu einer Erhöhung seiner Aktivität als fungizider Bestandteil26. Neben CNPs haben Wissenschaftler versucht, metallische Konjugate von Nanochitosan mithilfe vielseitiger Techniken wie der ionotropen Gelierungsmethode, der Emulsionsvernetzung usw. zu synthetisieren.27,28. Es gibt jedoch nur sehr wenige Berichte über die Verwendung von metallischem Nanochitosan als vielversprechendes Antimykotikum. Im Vergleich zu Chitosan und CNPs weisen mit Chitosan konjugierte Metall-NPs aufgrund ihrer veränderten strukturellen und funktionellen Eigenschaften, wie z. B. größerer Größe und Oberfläche, Vorhandensein von mehr kationischen Gruppen, aktiven funktionellen Gruppen und größerer Kondensationskapazität, mehr biologische Aktivitäten auf28.

Die Bekämpfung von Fusarium-Infektionen in wirtschaftlich wichtigen Nutzpflanzen ist für die Agrarforscher eine sehr anspruchsvolle Aufgabe. Bekämpfungsstrategien wie Fruchtwechsel, Einsatz von Pflanzenstoffen, biologische Bekämpfung und Stoppelbewirtschaftung sind für die Landwirte in der Praxis, aber die Erfolgsquote bei der Bekämpfung der Fäulniskrankheit war nicht zufriedenstellend29,30,31,32. Es wird berichtet, dass synthetische chemische Fungizide wie Mancozeb durch Saatgutbehandlung oder Sprühen diese Krankheit besser bekämpfen können33. Nur wenige Berichte früherer Autoren deuten auf die Verwendung von Mancozeb hin, um das Myzelwachstum von F. solani, das für die Entstehung der Fuß- und Wurzelfäule verantwortlich ist, um 50–100 Prozent zu hemmen34,35. Sein übermäßiger Einsatz ist jedoch aufgrund seiner hohen toxischen Wirkung auf den Boden und das Pflanzensystem umweltschädlich36. In diesem Zusammenhang ist die Berücksichtigung eines umweltfreundlichen, biologisch abbaubaren Moleküls wie Chitosan und seiner Konjugate vorzuziehen. Über die antipathogene Wirkung metallischer Nanopartikel wie Ag, Cu, Zn, Fe, Ni usw. wurde bereits von mehreren Forschern berichtet37. Der Kontakt von Metallnanopartikeln mit den Mikroben erzeugt oxidativen Stress, der eine Schädigung der Atemwegszellen hervorruft und den Proteinaustritt durch den Abbau der Membranpermeabilität erhöht. Eine Gruppe von Arbeitern zeigte die antimykotische Wirkung von Silber-Nanochitosan gegen den Fusarium-Artenkomplex38. Doch der Einsatz eines teuren Metalls wie Silber für die Landwirtschaft in Entwicklungsländern ist sowohl für die Landwirte als auch für die Regierung anstrengend.

Das Metall Nickel ist ein essentieller Mikronährstoff, der insbesondere für das Wachstum und die Erhöhung des Chlorophyllgehalts in Weizenkeimlingen (1 mg kg−1 Frischgewicht) benötigt wird39. Sein Mangel an Pflanzen kann sich negativ auf den Stickstoffstoffwechsel, die Fe-Aufnahme, das Pflanzenwachstum und die Seneszenz auswirken. Eine höhere Ni2+-Exposition wirkt sich jedoch giftig auf die Pflanzen aus und reichert sich im Boden an, was zu verschiedenen Gesundheitsrisiken führt40. Es gibt auch Berichte darüber, dass Ni2+-Ionen eine Zytotoxizität gegen eine große Anzahl von Phytopathogenen zeigen, indem sie die Fähigkeit zur Krankheitsresistenz im Pflanzensystem induzieren37. Nickel fungiert als Bestandteil mehrerer Metalloenzyme wie Urease, Superoxiddismutase, Methyl-Coenzym-M-Reduktase, Acetyl-Coenzym-A-Synthase usw. Daher verringert sein Mangel die Enzymaktivität und beeinträchtigt die Stickstoffassimilation41. Es handelt sich um ein inaktives Redoxmetall, das nicht direkt reaktive Sauerstoffspezies (ROS) erzeugt. Eine hohe Exposition kann jedoch zur Lipidperoxidation und zum Austritt von Elektrolyten in Pflanzen führen42. Somit ist Nickel ein lebenswichtiger Mikronährstoff, der für das Pflanzenwachstum und das reibungslose Funktionieren ihres Stoffwechsels unbedingt erforderlich ist. Der Einsatz dieses lebenswichtigen Metalls in minimaler Konzentration für die Synthese von Nanopartikeln führt zu einer erhöhten Bioaktivität des synthetisierten Moleküls gegen Phytopathogene. Bisher liegen nur sehr wenige Informationen über die Verwendung von mit Chitosan stabilisierten Nickel-Nanopartikeln gegen Phytopathogene vor43. Es wurden jedoch noch keine Informationen über die Bioaktivität von Nickel-Chitosan-Nanokonjugat (NiCNC) gegen den verheerenden Krankheitserreger Fusarium erfasst.

In unserer vorliegenden Studie haben wir metallische Nanokonjugate synthetisiert, indem wir ein Übergangsmetall und einen essentiellen Mikronährstoff – Nickel – in das Nanochitosan-Netzwerk eingebaut haben, indem wir eine Tripolyphosphat-Vernetzung entwickelt haben, und diese zur Bekämpfung der Fusariumfäule von Weizen eingesetzt. Die Anwendung von Nickel-Nanochitosan-Konjugat zur Bekämpfung der Fusariumfäule in Weizen und zur Verbesserung der Keimlingsvitalität durch Toleranz gegenüber pathogenem Stress ist ein neuartiger Ansatz. Der Vergleich zwischen CNPs und NiCNC würde uns helfen, die fördernde Wirkung metallischer Nanokonjugate (NiCNC) bei der Bekämpfung der Fusariumfäule gegenüber nicht konjugierten Chitosan-Nanopartikeln (CNPs) zu erkennen. In diesem Zusammenhang wurde Mancozeb zum Vergleich der Wirksamkeit von synthetisiertem Nanochitosan und Nickel-komplexiertem Nanochitosan mit kommerziellen synthetischen chemischen Fungiziden herangezogen. Daher werden die aus unserer Studie gewonnenen Daten dabei helfen, die Bekämpfungsmaßnahmen für Fusariumfäule in verschiedenen anderen Nutzpflanzen durch Biopolymer-Nanokonjugate zu untersuchen.

Als primäre Beobachtung wurde die Bildung von CNPs durch das Auftreten einer Opallösung und eines gelblich-orangefarbenen NiCNC-Hydrogels angezeigt. Die Ergebnisse der UV-sichtbaren Absorptionsspektroskopie zeigten einen charakteristischen Absorptionspeak für CNPs bei 203 nm und NiCNC bei 241 nm im UV-Bereich. Die hochauflösende Transmissionselektronenmikroskop-Analyse (HR-TEM) von CNPs zeigte feine kugelförmige Nanopartikel mit einer Größe zwischen 21 und 124 nm (gemessen mit der ImageJ-Software), während NiCNC eine Partikelgröße zwischen 300 und 400 nm aufwies. Sowohl CNPs als auch NiCNC zeigten übereinander verwickelte Agglomerationen mit rauer Oberflächenmorphologie, wie in der Feldemissions-Rasterelektronenmikroskop-Analyse (FE-SEM) festgestellt wurde. NiCNC zeigte eine hexagonale, blattartige Nanoscheibenmorphologie mit spitzen Kanten, die an die hochkristalline Natur des Nanopartikels erinnern. Die Spektralanalyse der energiedispersiven Röntgenspektrometrie (EDXS) zeigte das Vorhandensein von Nickel in NiCNC, was bestätigt, dass es sich um ein metallkonjugiertes Nanopartikel handelt. Alle notwendigen Elemente wurden in CNPs bestätigt. Die Spektralanalyse der Fourier-transformierten Infrarotspektroskopie (FT-IR) zeigte nahezu unterschiedliche Peakpositionen synthetisierter CNPs und NiCNC. Der FT-IR-Absorptionspeak bei 3302,56 und 3173,68 cm−1 von CNPs bzw. NiCNC entspricht der O-H-Gruppe und der N-H-Gruppe der Streckschwingungen. Die Absorptionsbande bei 1675,45 und 1628,22 cm−1 zeigte das Vorhandensein einer Amid-I-Bande in CNPs bzw. NiCNC. Der bei 1379,09 cm−1 erhaltene Peak weist auf das Vorhandensein von –C–O–H in ebenen Biegeschwingungen oder –CH2-Schwingen oder Verdrehen in NiCNC hin. Die Absorptionsbande bei 1527,94 cm−1 ähnelt N-H-Biegeschwingungen (Amid II) in NiCNC, die in CNPs fehlen. Der bei 1275,63 cm−1 für CNPs erhaltene Peak weist auf das Vorhandensein von P = O-Streckschwingungen hin. Alle im Fall von NiCNC erhaltenen Peaks zwischen 400 und 600 cm−1 sind charakteristische Peaks für Metalloxidschwingungen. Der für NiCNC erhaltene intensive Peak bei 576,93 cm−1 ist auf die durch die Ni-O-Bindung verursachten Vibrationen zurückzuführen (Abb. 1).

Nano-Hydrogel-Bilder von (a) CNPs und (b) NiCNC, erhalten durch die ionotrope Gelierungsmethode; Charakterisierung von CNPs und NiCNC durch (c) UV-Vis-Spektren von CNPs und NiCNC; FE-SEM-Analyse von (d) CNPs und (e) NiCNC; HRTEM-Analyse von (f) CNPs und (g) NiCNC; Histogramm der Partikelgrößenverteilung von (h) CNPs und (i) NiCNC; EDXS-Analyse von (j) NiCNC und (k) CNPs und FT-IR-Analyse von (l) CNPs und (m) NiCNC.

Die antimykotische Aktivität von CNPs und NiCNC wurde durch Bestimmung des Koloniedurchmessers von F. solani bewertet, der in PDA-Medien gezüchtet wurde, die mit unterschiedlichen Konzentrationen beider Nanopartikel behandelt wurden. Nach 7 Tagen Inkubation wurde beobachtet, dass NiCNC im Vergleich zu CNPs effizientere Ergebnisse bei geringerem Koloniedurchmesser zeigte. Der Koloniedurchmesser nahm mit zunehmender Konzentration von CNPs und NiCNC zunehmend ab. Das kommerzielle Fungizid Mancozeb zeigte in seiner empfohlenen Dosierung keine signifikante Aktivität in Bezug auf NiCNC (p ≤ 0,05). Die unbehandelte Platte zeigte innerhalb von 7 Tagen ein vollständiges Koloniewachstum (Abb. 2). Bei NiCNC wurde bei 0,04 mg/ml eine 100-prozentige Hemmung des radialen Wachstums beobachtet, wohingegen 0,04 mg/ml CNPs eine Wachstumshemmung von 65,50 % zeigten. Andererseits zeigte Mancozeb bei seiner empfohlenen Dosis einen Hemmungsprozentsatz von 52,90. Die antimykotische Aktivität von NiCl2 bei 0,04 mg/ml und 0,06 mg/ml erwies sich als unwirksam gegen den Zielpilz. Beide NiCl2-Konzentrationen zeigten eine Hemmung des Myzelwachstums von 28 % und 32 %.

Wirkung von CNPs und NiCNC auf das radiale Myzelwachstum von F. solani. (a) Myzel-Radialwachstum von F. solani mit unterschiedlichen Konzentrationen (0,001, 0,01, 0,02, 0,03 und 0,04 mg/ml) von CNPs und NiCNC auf der PDA-Platte; (b) Grafische Darstellung des Koloniedurchmessers von F. solani mit unterschiedlichen Konzentrationen von CNPs und NiCNC im Vergleich zu Mancozeb, NiCl2 und der Kontrolle 7 Tage nach der Inkubation; (c) Diagramm, das die prozentuale Hemmung des radialen Wachstums (PIRG) von F. solani unter getesteten Konzentrationen von CNPs und NiCNC zeigt. Die Werte sind Durchschnittswerte aus drei Wiederholungen (n = 3), Fehlerbalken geben die Standardabweichung (SD) an und verschiedene Buchstaben (a, b, c usw.) zeigen einen signifikanten Unterschied zwischen den Behandlungen bei p ≤ 0,05 gemäß Duncans Multiple Range Test an.

Zur weiteren Aufklärung der antimykotischen Aktivität der Nanopartikel untersuchten wir den Prozentsatz der Hemmung der Sporenkeimung. Bei der Beobachtung unter dem Lichtmikroskop nach 6-stündiger Behandlung wurde bei der NiCNC-Behandlung im Vergleich zu unbehandelten und mit CNPs behandelten Sporen eine deutliche Verringerung der Sporenkeimung beobachtet. Wenn die Sporen 0,04 mg/ml NiCNC-Lösung ausgesetzt wurden, zeigte sich eine 100-prozentige Hemmung der Sporenkeimung, wohingegen die Mancozeb-Dosis nur eine Hemmung der Sporenkeimung von 57,83 % zeigte. Andererseits zeigte die Behandlung von F. solani-Sporen mit 0,04 mg/ml CNPs eine Hemmung der Sporenkeimung um 89 %. Der IC50-Wert von CNPs und NiCNC wurde mit 0,021 bzw. 0,019 mg/ml ermittelt (Abb. 3).

Wirkung von CNPs und NiCNC auf den Hemmungsprozentsatz der Sporenkeimung von F. solani. (a) Mikroskopische Bilder der Hemmung der Sporenkeimung von F. solani mit unterschiedlichen Konzentrationen (0,001–0,04 mg/ml) von CNPs und NiCNC im Vergleich zu Mancozeb (16 mg/ml) und unbehandelten (Kontroll-)Sporen (Vergrößerung = 400-fach) ; (b) Prozentsatz der Hemmung der Sporenkeimung von F. solani. Die Daten werden als Mittelwert ± SD (n = 3) ausgedrückt. Verschiedene Buchstaben weisen auf einen signifikanten Unterschied zwischen den Behandlungen bei p ≤ 0,05 hin. (c) IC50-Werte von CNPs und NiCNC.

Die Wirkung unterschiedlicher Konzentrationen von CNPs und NiCNC über 72 Stunden auf die Unterdrückung der Sporulation von F. solani zeigte, dass die Behandlung mit NiCNC mit zunehmendem Konzentrationsbereich zu einem signifikanten Rückgang der Konidienbildung führte. Die unbehandelte Platte zeigte 0,83 × 106 Konidien/ml, wohingegen NiCNC und CNPs bei einer Konzentration von 0,04 mg/ml zur Bildung von 0,02 × 106 bzw. 0,05 × 106 Konidien/ml führten. Im Gegensatz dazu erzeugte die Mancozeb-Dosis 0,13 × 106 Konidien/ml (Abb. 4).

Wirkung der getesteten Konzentrationen von CNPs und NiCNC auf die Unterdrückung der Sporulation von F. solani. (a) Sporulationszahl auf dem Hämozytometer, beobachtet unter dem Lichtmikroskop; (b) Grafische Darstellung der Wirkung von CNPs und NiCNC im Vergleich zu Mancozeb und unbehandelten (Kontroll-)Sporen auf die Bildung von Konidien; Die Werte sind Mittelwerte aus drei Wiederholungen (n = 3), Fehlerbalken zeigen SD an und verschiedene Buchstaben (a, b, c usw.) zeigen einen signifikanten Unterschied zwischen den Behandlungen bei p ≤ 0,05 an.

Mit NiCNC behandelte Sporen erwiesen sich mit einem Lebensfähigkeitsprozentsatz von 13 bei 0,04 mg/ml als weniger lebensfähig im Vergleich zu unbehandelten Sporen, die eine Lebensfähigkeit von 90 % zeigten. Die Behandlung mit CNPs (0,04 mg/ml) zeigte 28 % lebensfähige Sporen im Medium. Mit Mancozeb (16 mg/ml) kultivierte Sporen zeigten 56 % lebensfähige Sporen (Abb. 5a).

Einfluss unterschiedlicher Konzentrationen von CNPs und NiCNC auf (a) den Prozentsatz der Sporenlebensfähigkeit und (b) den MDA-Prozentsatz von F. solani; Fluoreszenzmikroskopische Beobachtungen zeigen die Entstehung von oxidativem Stress in Konidien und Myzel von F. solani aufgrund der Wirkung von (c) NiCNC (0,04 mg/ml), (d) CNPs (0,04 mg/ml), (e) Mancozeb (16 mg/ml). mL) und (f) unbehandeltes Myzel; morphologische Veränderungen von F. solani-Konidien, die direkt (g) NiCNC (0,04 mg/ml), (h) CNPs (0,04 mg/ml), (i) Mancozeb (16 mg/ml) und (j) destilliertem Wasser ausgesetzt waren, beobachtet unter Rasterelektronenmikroskop.

Die höchste verwendete NiCNC-Konzentration erzeugt in den Pilzen 77,77 % Malonaldehyd (MDA), während die unbehandelten Pilze 0,00 % MDA aufweisen. Andererseits produzieren CNPs maximal 38,66 % MDA, wenn die Pilze mit Konzentrationen von 0,04 mg/ml behandelt wurden (Abb. 5b). Im Gegensatz dazu zeigte die Mancozeb-Behandlung 32,00 % MDA.

Der Grad der im Pilzsystem erzeugten ROS nach 72-stündiger Anwendung der Nanopartikel wurde mit der DCFH-Färbemethode gemessen. Abbildung 5c–f zeigt unter dem Fluoreszenzmikroskop beobachtete Bilder im Zusammenhang mit dem ROS-Spiegel, der in unbehandeltem, mit NiCNC, CNPs und Mancozeb behandeltem Pilzmyzel erzeugt wird. Unsere vorliegende Studie zeigte die Erzeugung einer höheren Fluoreszenzintensität in NiCNC-behandeltem Pilzmyzel, gefolgt von einer CNPs- und Mancozeb-Behandlung, die eine mäßige Fluoreszenzintensität zeigte. Für unbehandeltes Pilzmyzel wurde keine Fluoreszenzausprägung beobachtet.

Die 72-stündige Anwendung synthetisierter Nanopartikel veränderte die Morphologie der Konidien von F. solani. Beide Nanopartikel führten zu einer ausgeprägten Depression der Konidienmorphologie, was zu einer vollständigen Verformung und schweren Schäden an der Membran führte. Die unbehandelten Pilzkonidien zeigten eine gut entwickelte, gleichmäßige Oberflächenmorphologie ohne strukturelle Anomalien. Die Behandlung mit Mancozeb führte im Vergleich zu den unbehandelten Konidien zu einer leichten Vertiefung der Konidienoberfläche; Ansonsten gab es keinen signifikanten Unterschied (Abb. 5g – j).

Am Ende des 20. Tages wurden die Symptome der inokulierten Sämlinge anhand der 5-stufigen Skala von Santori und Infantino (2009) analysiert (Tabelle 1). Bei mit NiCNC behandelten Sämlingen wurde im Vergleich zu unbehandelten Sämlingen eine signifikante Verringerung der Krankheitsinzidenz beobachtet. Die unbehandelten Sämlinge zeigten eine Krankheitsinzidenz von 93,33 % mit einer dunkelbraunen Färbung des Stamm- und Wurzelteils des Sämlings. Außerdem wurden nach 20 Tagen 36,66 % abgestorbene Pflanzen auf der Schale festgestellt, die nach der Infektion nicht überleben konnten. Mit NiCNC behandelte Sämlinge zeigten jedoch eine nahezu gesunde Vitalität mit nur 16,67 % der Infektionen. Sowohl die CNPs- als auch die Mancozeb-Behandlung zeigten bei den Sämlingen eine moderate Infektionsrate von 50 % bzw. 53,33 % (Abb. 6a – h).

Krankheitssymptome von nicht inokulierten und mit F. solani inokulierten Weizenkeimlingen am 20. Tag, ausgesetzt gegenüber (a,b) destilliertem Wasser (unbehandelt), (c,d) CNPs (0,04 mg/ml), (e,f) NiCNC (0,04 mg). /ml) und (g,h) Mancozeb (16 mg/ml); (i) Längsschnitt des Stammes des mit destilliertem Wasser behandelten und mit F. solani inokulierten erkrankten Sämlings und (j) mit NiCNC behandelter und mit F. solani inokulierter Sämling. Es wurde beobachtet, dass sich infektiöse Hyphen nur im Gewebe unbehandelter Sämlinge verzweigten.

Zur weiteren Bestätigung des Auftretens von Krankheiten bei den Sämlingen wurden anatomische Schnitte des Stammteils sowohl der unbehandelten erkrankten als auch der mit NiCNC behandelten inokulierten, im Boden gewachsenen Sämlinge durchgeführt. Unter dem Mikroskop wurde beobachtet, dass die erkrankten Sämlinge braun gefärbte, weniger Chlorophyll verrottende Zellen mit deutlichem Auftreten von Infektionszapfen oder Appressorium aufwiesen, die sich zu primären infektiösen Hyphen differenzierten, die sich weiter zu invasiven Hyphen entwickelten. Darüber hinaus wiesen diese Zellen eine völlig zerstörte Zellwand auf. Im Gegensatz dazu zeigten mit NiCNC behandelte Sämlinge frische grüne und gesunde Zellen mit intakter Zellwand (Abb. 6i – j).

Unter allen Behandlungen zeigten Sämlinge mit NiCNC-Behandlung einen höheren Vitalitätsindex. Bei mit CNPs behandelten Sämlingen wurde eine mäßige Vitalität beobachtet. Bei mit Mancozeb behandelten Sämlingen wurde eine verzögerte Vitalität mit kurzer Spross- und Wurzellänge beobachtet. Bei unbehandelten Sämlingen wurde ein normales Vitalitätsmuster beobachtet (Abb. 7a, b). Die Wirkung der CNPs- und NiCNC-Behandlung bei der Abschwächung von pathogenem Stress auf die Keimlingsvitalität wurde anhand des Stresstoleranzindex für Pflanzenhöhe und Wurzellänge bewertet. Sämlinge, die mit F. solani inokuliert und weiter mit 0,04 mg/ml NiCNC behandelt wurden, zeigten maximale Pflanzenhöhe und Stresstoleranzindex für die Wurzellänge. Mit CNPs behandelte inokulierte Sämlinge zeigten einen moderaten Stresstoleranzindex für Pflanzenhöhe und Wurzellänge. Mit Mancozeb behandelte beimpfte Sämlinge zeigten einen niedrigeren Stresstoleranzindex als die beiden verwendeten Nanopartikel. Mit F. solani ohne Behandlung geimpfte Sämlinge zeigten unter allen Behandlungen die geringste Toleranz gegenüber pathogenem Stress (Abb. 7c – e).

(a) Beobachtung der morphologischen Vitalität von mit F. solani inokulierten Weizenkeimlingen am 20. Tag, behandelt mit destilliertem Wasser, CNPs, NiCNC und Mancozeb; (b) Prozentsatz der Krankheitsinzidenz unterschiedlich behandelter Weizenkeimlinge; (c) Pflanzenhöhe und (d) Stresstoleranzindex für die Wurzellänge von mit F. solani inokulierten Weizensämlingen, die mit destilliertem Wasser (unbehandelt), CNPs, NiCNC und Mancozeb behandelt wurden; (e) Vitalitätsindex von nicht inokulierten und mit F. solani inokulierten Weizenkeimlingen am 20. Tag. Die Werte sind Mittelwerte aus drei Wiederholungen (n = 3), Fehlerbalken zeigen SD an und verschiedene Buchstaben (a, b, c usw.) zeigen einen signifikanten Unterschied zwischen den Behandlungen bei p ≤ 0,05 an.

Säugetierzelllinien wurden einem Bereich steigender Konzentrationen (0,01–0,4 mg/ml) von CNPs und NiCNC ausgesetzt, um ihren Zytotoxizitätsprozentsatz bei jeder Konzentration zu bewerten. Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass beide Nanopartikel im unteren Konzentrationsbereich von 0,01–0,250 mg/ml keine toxische Wirkung auf die ausgesäten Zellen haben. Die Zellen wurden durch die Behandlung mit den Nanopartikeln nicht beeinträchtigt und vermehrten sich gesund. Daher blieb die Lebensfähigkeit der Zellen in Gegenwart beider Nanopartikel unverändert. Wenn jedoch die Konzentration beider Nanopartikel auf 0,3 mg/ml ansteigt, kommt es zu einer Veränderung der Zellen, die eine negative Reaktion hervorruft und zu einer Fortpflanzungsunfähigkeit der Nierenzellen führt.

Um die negativen Auswirkungen synthetischer Fungizide auf die Umwelt und die öffentliche Gesundheit zu minimieren, gewinnt die Verwendung natürlicher biologischer Produkte wie Chitosan in der Forschungswelt zunehmend an Aufmerksamkeit. Chitosan gilt als starker Chelatbildner, der leicht Komplexe mit Übergangsmetallen und Schwermetallen bilden kann44. Verschiedene Forscher haben sich auf die Anwendung von Chitosan-Metallkomplexen bei der Sequestrierung von Metallionen, beim Färben, bei der Wasseraufbereitung, bei der Katalyse und verschiedenen anderen industriellen Anwendungen konzentriert. Ein Bericht legt jedoch nahe, dass Chitosan-Metall-Komplexe mit zweiwertigen Ionen (Cu, Zn, Ni, Fe) aufgrund der veränderten Strukturveränderungen im Chitosan-Molekül mit -NH2 und -OH eine vielversprechende antipathogene Aktivität als Massen-Chitosan oder freie Metallsalze verleihen als dominierende reaktive Zentren45. Chitosan und Nanochitosan hemmen bekanntermaßen ein breites Spektrum an Pilzpathogenen wie Alternaria solani, F. oxysporum, Aspergillus niger, Penicillium spp., Candida spp., Cordyceps militaris usw.46,47,48.

Der Einsatz von Nickel-Chitosan-Nanokonjugat zur Bekämpfung von Fusariumfäule in Weizen hat zu einer deutlichen Reduzierung der Krankheitsinzidenz um 83,33 % geführt. Bei einer In-vitro-Untersuchung zeigte NiCNC bei 0,04 mg/ml eine vollständige Beendigung des Wachstums der Pilzkolonie auf der PDA-Platte. Es wurde beobachtet, dass mit der allmählichen Erhöhung der NiCNC-Konzentration der Durchmesser der Pilzkolonie abnimmt. Dies bestätigt die dosisabhängige Aktivität metallischer Nanopartikel, wie sie von verschiedenen Autoren vorgeschlagen wurde49,50. Unser Ergebnis legt nahe, dass NiCNC im Vergleich zu einer Dosis Mancozeb und getesteten CNP-Konzentrationen eine signifikantere antimykotische Wirkung auf F. solani hatte. Mancozeb reduzierte das Pilzmyzelwachstum um 53 %. Es handelt sich um ein Dithiocarbamat-Fungizid, das vom Fungicide Resistance Action Committee (FRAC) als Multi-Site-Wirkung eingestuft wurde51. Es wird berichtet, dass synthetische Fungizide wie Mancozeb in Modellorganismen von Säugetieren zahlreiche Fehlfunktionen aufweisen52. Es beeinträchtigt akut die männliche Fruchtbarkeit, Magen-Darm-Probleme, Kratzen im Hals, Reizungen, Niesen, Husten, Bronchitis und transdermale Absorption53,54. Informationen über die potenzielle Toxizität von Mancozeb und anderen ähnlichen chemischen Fungiziden sollten ihren Einsatz in landwirtschaftlichen Feldern, insbesondere bei weltweit konsumierten wichtigen Nahrungspflanzen wie Weizen, nicht unterstützen. Es ist in der Europäischen Union seit 2021 aufgehoben, wird jedoch in verschiedenen südostasiatischen Ländern weit verbreitet55. Andererseits zeigten 0,04 mg/ml CNPs eine Wachstumshemmung von 65,50 %, was darauf schließen lässt, dass es sich um ein weniger wirksames Antimykotikum als NiCNC handelt. Die induktiven Wirkungen von metallischen Nanopartikeln oder Chitosan-Metallkomplexen auf verschiedene Phytopathogene werden von verschiedenen Forschern bereits als effizienter beschrieben56,57,58,59. Die antimykotische Aktivität der NiCl2-Massenlösung bei 0,04 mg/ml und 0,06 mg/ml erwies sich als unwirksam gegen das Wachstum von F. solani. Selbst bei einer höheren Konzentration von 0,06 mg/ml NiCl2 gedeiht der Zielerreger mit einem bemerkenswerten Koloniewachstum. Es ist ein klarer Hinweis darauf, dass NiCl2, wenn es mit Nanochitosan gestanzt wird, bei den oben genannten Konzentrationen eine potenzielle antimykotische Aktivität verleiht60. Die Anwendung von Ag-Chitosan-Nanokomposit gegen Fusarium spp. zeigten eine vollständige Hemmwirkung bei 1 mg/ml, wohingegen NiCNC in unserer Studie eine vollständige Hemmung von F. solani bei einer sehr niedrigen Dosis (0,04 mg/ml) zeigte28. Eine gründliche Durchsicht der früheren Arbeiten stützt nachdrücklich die Annahme, dass Ni2+-Ionen bei der Absorption in Chitosan eine verstärkte Hemmwirkung gegen eine Reihe von Pflanzenpathogenen zeigten61.

NiCNC ist in der Lage, die Keimung von F. solani-Sporen bei 0,04 mg/ml erfolgreich zu hemmen. Sporen sind die kleinste Vermehrungseinheit jedes Pilzpathogens, die zur erfolgreichen Etablierung einer Krankheit in der Wirtspflanze führt62. Die Sporenkeimung ist sowohl für die vegetative als auch für die reproduktive Entwicklung des Erregers von entscheidender Bedeutung. Die Keimung von Sporen reagiert sehr empfindlich auf abiotischen Stress, Ernährungsstress und Wirt-Pathogen-Kommunikation63. Die vollständige Beendigung des Sporenkeimungsprozesses bei der höchsten getesteten Konzentration von NiCNC macht es zu einem wirksamen sporiziden Mittel gegen F. solani. Aus den erhaltenen Ergebnissen ging hervor, dass NiCNC eine stärkere antimykotische Aktivität aufwies als CNPs und Mancozeb, wie wir im Fall des radialen Koloniewachstums festgestellt haben.

Verschiedene Forscher haben in ihren früheren Studien die Verwendung von Metall- und Metalloxid-Nanopartikeln als Antimykotikum empfohlen64. Arbeiten von Wani und Shah aus dem Jahr 201265 ergaben, dass die Sporenkeimung bei Krankheitserregern wie Fusarium oxysporum, Alternaria alternata und Rhizopus stolonifer deutlich gehemmt wurde, wenn ihre Sporen mit Magnesiumoxid- und Zinkoxid-Nanopartikeln behandelt wurden. Genauer gesagt hat die Absorption von Ni2+-Ionen in Chitosan großen Einfluss auf die Wachstumshemmung von Candida albicans66. NiCNC kann offensichtlich auf die Bildung von Konidien abzielen, wenn es der höchsten getesteten Konzentration unter einem geeigneten Sporulationsmedium ausgesetzt wird. Man kann davon ausgehen, dass die direkte Wechselwirkung zwischen Chitosan-Metallkomplex und Hyphen die zelluläre Proteinstruktur und ihre chemische Natur stört, von denen einige an der Bildung von Konidiophoren beteiligt sind67. Darüber hinaus stimmen die Ergebnisse unseres Experiments mit dem Ergebnis von Ahmed et al. überein. (2016)57, wo sie darlegten, dass Ni-Nanopartikel bei 50 ppm einen signifikanten Anstieg der sporiziden Aktivität gegen Fusarium-Arten zeigten.

Der kolorimetrische Test von XTT [2,3-Bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenyl-amino)carbonyl]-2H-tetrazoliumhydroxid wurde ursprünglich zur Überprüfung der vegetativen und reproduktiven Eigenschaften entwickelt Lebensfähigkeit einiger klinisch wichtiger Pilze wie Candida spp., Saccharomyces cervisiae, Penicillium chryogenum, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Trichoderma atroviride68. Manchmal wird die Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration für Pilze aufgrund des inhomogenen Wachstums von Hyphen und Filamenten schwierig. Diese kolorimetrische Quantifizierung des Pilzwachstums ist bekanntermaßen präziser und genauer. Es ist bekannt, dass dieser Test eine vollständige Hemmung der Stoffwechselaktivitäten innerhalb der Pilzpathogene bewirkt, wodurch die Sporenkeimung und ihre Lebensfähigkeit beeinträchtigt werden69,70. Es wurde offensichtlich beobachtet, dass mit zunehmender NiCNC-Dosierung der Prozentsatz der Lebensfähigkeit der Sporen abnimmt. Unsere Ergebnisse stützen nachdrücklich die Ergebnisse von Ghasemian et al. (2012), wo sie erwähnten, dass metallische Nanopartikel den Prozentsatz der Sporenlebensfähigkeit wirksam reduzieren, insbesondere bei Fusarium solani, und 60 mg/ml (minimale Hemmkonzentration) von Kupfernanopartikeln erwiesen sich als wirksames sporizides Mittel, wie sie zeigten68. Es ist erwiesen, dass die elektrostatische Wechselwirkung zwischen den positiven Ladungen der Nanokonjugate und den negativ geladenen Pilzzellkomponenten zu einer Membrandestabilisierung und einem zellulären Protoplasmaaustritt führt, was zu nicht lebensfähigen Sporen führt38,71.

Die Wirkung von NiCNC und CNPs auf die Lipidperoxidation von Pilzen wurde durch Bestimmung der MDA-Spiegel bewertet, die als Folge der Erzeugung von intrazellulärem Stress aufgrund der Anwendung von Nanopartikeln entstehen. Die in der Pilzmembran vorhandenen mehrfach ungesättigten Fettsäuren enthalten Methylengruppen (–CH2–), die durch die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) beeinträchtigt werden und dadurch eine Peroxidation von Lipiden verursachen. Dieses Phänomen der Lipidperoxidation zerstört die Integrität der Pilzmembran vollständig und erzeugt als Aldehyd-Nebenprodukt MDA, einen Indikator für die Lipidperoxidation. Dieses produzierte MDA reagiert mit 2'-Desoxyguanosin (M1G-dR), das in der Pilz-DNA vorhanden ist, und bildet ein Propan-Addukt. Dieser Prozess beeinflusst den Pilzstoffwechsel erheblich, indem er verschiedene physiologische Funktionen der Zelle beeinflusst, einschließlich Zellsignalisierung, Wachstum und Proliferation, Differenzierung und Apoptose72. In der vorliegenden Studie wurde festgestellt, dass die MDA-Werte in Pilzen mit steigenden NiCNC-Konzentrationen im Vergleich zur Kontrolle erhöht waren. Der Anstieg der MDA-Spiegel ist auf die schädliche Wirkung von ROS zurückzuführen, die durch die Wechselwirkung mit Pilzmembranlipiden entsteht. Unsere Studie zeigte die größte schädliche Wirkung der NiCNC-Behandlung auf die Zellintegrität von Pilzen im Vergleich zu CNPs und Mancozeb.

Die in den Pilzmyzelien und Konidien beobachtete Fluoreszenzintensität ist direkt proportional zum Grad der ROS, die durch Stress bei der Exposition gegenüber Nanopartikeln erzeugt werden73,74. Die Tatsache, dass metallische Nanopartikel messbar mehr intrazelluläre ROS produzieren können als ihre Massengegenstücke, kann durch unser Experiment gut gefolgert werden75. In unserer Studie wurde beobachtet, dass 0,04 mg/ml NiCNC durch die Emission hoher Fluoreszenzintensität maximalen oxidativen Stress in Pilzmyzel und Konidien erzeugen, wohingegen CNPs (0,04 mg/ml) und Mancozeb (16 mg/ml) mäßigen oxidativen Stress erzeugen Intensität der Fluoreszenz. Es kann klar festgestellt werden, dass NiCNC im Vergleich zu CNPs und synthetischen Fungiziden maximalen oxidativen Stress im Pilzsystem erzeugen kann. Durch die Behandlung mit metallischen Nanopartikeln erzeugte ROS können die Membranintegrität und -funktionalität der Pilze vollständig beeinträchtigen und so zu Wachstumshemmung und Tod führen72. In einer Studie wurde gezeigt, dass der Anstieg des ROS-Spiegels den Gehalt an Oxidationsmitteln und Antioxidantien aus dem Gleichgewicht bringen kann, was zu hohem oxidativen Stress und anschließender Freisetzung von Cytochrom C führt, was zur Zellapoptose führt76. Es wurde nachgewiesen, dass die Agglomeration von Metallen in Chitosan gegen F. oxysporum eine hohe Fluoreszenzintensität erzeugt, was unsere Studie stark unterstützt38.

Sowohl die NiCNC- als auch die CNP-Behandlung von Pilzkonidien hat zu schweren irreversiblen Schäden an der Konidienmembran geführt, einschließlich gebrochener Enden mit erhöhter Membranpermeabilität und verschiedenen Oberflächenanomalien, die mittels REM analysiert wurden. Die Anwendung von NiCNC auf den Konidien führt zum Verlust ihres protoplasmatischen Inhalts, gefolgt von einem Zellaustritt, und scheint wie durchstochene Konidien auszusehen. Dieses Ergebnis war völlig kompatibel mit den Ergebnissen von Dananjaya et al. (2017) über die Behandlung von Silber-Chitosan-Nanopartikeln gegen F. oxysporum, wo sie Zellwandschäden und Veränderungen der Membranpermeabilität beobachteten. Zuvor wurde bestätigt, dass Metalloxid-Nanopartikel an der Oberfläche der pathogenen Bakterien andocken können77.

In-vivo-Experimente ergaben, dass 0,04 mg/ml NiCNC den sich entwickelnden Weizenkeimlingen maximalen Schutz gegen den Angriff von F. solani bieten. Dieses Chitosan-Metall-Konjugat konnte die Erkrankungshäufigkeit auf 16,67 % senken. Diese Konzentration kann für die Induktion einer Resistenz bei Weizenkeimlingen gegen die Fäulniskrankheit in Betracht gezogen werden. Forscher haben bereits die biologische Rolle von Chitosan und seinen Nanopartikeln als Resistenzauslöser gegen Pilzbefall, insbesondere gegen Fusarium spp.78, nachgewiesen. Verschiedene Berichte deuten darauf hin, dass Chitosan selbst die angeborene Immunität von Pflanzen wirksam auslöst, da es nur einen geringen Schweregrad der Symptome aufweist79. Wissenschaftler haben bestätigt, dass die Behandlung mit Chitosan und seinen Nanoderivaten die Krankheitsresistenz von Sämlingen während der Keimungsphase erheblich verbessern könnte80. Darüber hinaus könnten metallische Konjugate von Nanochitosan die Fähigkeit zur Krankheitsresistenz weiter verbessern, wie anhand des Krankheitsinzidenzattributs unserer Studie ermittelt wurde.

Die Behandlung mit NiCNC dient nicht nur der Vorbeugung von Fäulniskrankheiten, sondern kann auch den Vitalitätsindex der Sämlinge wirksam stimulieren. Mit NiCNC behandelte Sämlinge sind größer und haben grüne, gesunde Blätter mit einer größeren Wurzellänge als die mit synthetischem Fungizid, CNPs und destilliertem Wasser behandelten Sämlinge. Mit synthetischen Fungiziden behandelte Sämlinge zeigten aufgrund des verzögerten Wachstums bei geringer Pflanzenhöhe und kleineren Wurzeln einen niedrigen Vitalitätsindex, was auf die phytotoxische Wirkung des Fungizids auf die Sämlinge hinweisen könnte. Dies bestätigt die pflanzenwachstumsfördernde Wirkung von Chitosan-Nanopartikeln und seinen Derivaten. Chitosan ist als Pflanzenwachstumsregulator bekannt, der die Biomasse der Pflanze erhöht, indem er die Transpirationsrate senkt. In jüngster Zeit haben Forscher große Aufmerksamkeit auf den Mechanismus der pflanzenwachstumsfördernden Aktivität von Nanopartikeln auf Chitosanbasis gerichtet81,82. Es wurde nachgewiesen, dass Chitosan-Nanopartikel das Keimlingswachstum durch eine angereicherte Nährstoffaufnahme, zu der Stickstoff, Kalium, Kalzium, Phosphor und Magnesium gehören, deutlich steigern können83. Genauer gesagt konnte der Schluss gezogen werden, dass Chitosan und seine Nanoderivate das Wachstum keimender Weizenkeimlinge durch die Aktivierung des IAA-Signalwegs fördern84,85. Die Ergebnisse unserer Studie stimmen mit den Erkenntnissen früherer Autoren überein und es könnte vermutet werden, dass die Behandlung mit Chitosan-Nanopartikeln und seinen metallischen Derivaten das Wachstum der Weizenkeimlinge unter biotischer Belastung aktiv steigern könnte. Forscher kamen zu dem Schluss, dass die Behandlung mit Chitosan-basierten Nanopartikeln zu einer 1,5-fachen Verlängerung der Pflanzenwurzel- und -sprosslänge beitrug86. Dieser Anstieg war in unserer Studie deutlich zu erkennen und zeigte eine erhöhte Pflanzenhöhe nach der Behandlung mit NiCNC im Vergleich zu unbehandelten, mit CNPs und Mancozeb behandelten Sämlingen (Abb. 7e).

Es ist auch bekannt, dass Ni2+-Ionen zur vegetativen Proliferation der Nutzpflanzen beitragen, und ein Mangel an Ni2+-Ionen kann zu einem verminderten vegetativen Wachstum, einer verstärkten Seneszenz der Pflanzen, einem gestörten Stickstoffstoffwechsel, der Entwicklung von Chlorose, einer Verkümmerung der Blätter, einer schlechten Pflanzenarchitektur und einer Behinderung der normalen Fe-Aufnahme führen87 . Eine geringere Nickelbelastung der Pflanzen verbessert die Samenkeimung, die Chlorophyllsynthese und die Seitenwurzelbildung. Untersuchungen ergaben, dass Nickel eine herausragende Rolle bei der Synthese von Phytoalexinen und der Induktion von Krankheitsresistenz in Pflanzen spielt88. Wie bereits in der Einleitung erwähnt, dient dieses Ni2+-Ion als Co-Faktor verschiedener Metalloenzyme wie Urease, Kohlenmonoxid-Dehydrogenase usw. Daher ist es offensichtlich, dass Nickel ein essentieller Mikronährstoff ist, der in geringerer Konzentration für die normale Funktion des Körpers benötigt wird Pflanze und die Verschmelzung von Nickel mit Chitosan kann seine Bioaktivität bei der Anwendung auf Pflanzen erhöhen. Aus der Literatur geht hervor, dass Nutzpflanzen durchschnittlich 3–1000 mg Ni/kg landwirtschaftlicher Boden benötigen, was für ein normales Wachstum und Funktionieren ohne toxische Wirkung erforderlich ist89. In unserem Experiment enthält die höchste getestete bioaktive Konzentration, nämlich 0,04 mg/ml NiCNC-Hydrogellösung, tatsächlich 38 % Ni (geschätzt durch EDXS-Analyse), was ungefähr 0,00668 mg/ml Ni bei Anwendung auf jeden Sämling entspricht. Die Experimente wurden in Kunststoffschalen mit 5 kg Erde für 30 Setzlinge durchgeführt. Jeder Sämling wurde mit 5 ml NiCNC-Lösung behandelt, daher wurden für 30 Sämlinge 150 ml NiCNC in 5 kg Erde ausgebracht. Nun würden 150 ml NiCNC (0,00668 mg/ml × 150 ml) 1,002 mg/ml Ni in 5 kg Boden (0,2 mg/ml Ni pro kg Boden) enthalten, was eine extrem niedrige Dosis darstellt und kein Risiko einer Toxizität birgt Metallanreicherung im Boden42. Daher kann das synthetisierte Nickel-Chitosan-Nanokonjugat als umweltfreundliches und ungiftiges Antimykotikum angesehen werden43.

Die Stresstoleranzanalyse der mit F. solani inokulierten Sämlinge ergab, dass die Anwendung von NiCNC durch die Beschleunigung der Pflanzenhöhe und Wurzellänge eine größere Toleranz gegenüber pathogenem Stress induziert. Es ist bekannt, dass Stress, der durch eine pathogene Infektion in Pflanzen verursacht wird, die Pflanzenhöhe beeinflussen und die Wurzelproliferation beeinträchtigen kann, was zu einem verzögerten Wachstum führt. Die mit destilliertem Wasser behandelten Sämlinge konnten dem pathogenen Stress nicht standhalten, was zum Absterben der Pflanzen führte. Mit CNPs behandelte Sämlinge zeigten im Vergleich zur NiCNC-Behandlung eine mäßige Stresstoleranzkapazität. Mit Mancozeb behandelte Sämlinge führten im Vergleich zur CNP-Behandlung zu einer geringeren Toleranz gegenüber pathogenem Stress. Unsere Studie legt nahe, dass die Aktivität synthetischer Fungizide Fäulniskrankheiten und das Eindringen von Krankheitserregern nicht erfolgreich bekämpfen kann. Vielmehr kann der übermäßige Einsatz synthetischer Fungizide zu Toxizität für Pflanzen, Boden und Umwelt führen36. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen deutlich die fördernde Wirkung des in das Chitosan-Netzwerk eingefügten Metallions (Ni2+). Die Bedeutung des Einbaus von Nickelionen in das Chitosan-Netzwerk besteht darin, eine verstärkte wachstumsfördernde Aktivität der Weizensämlinge und eine Erhöhung der antipathogenen Aktivität gegenüber Massen-Chitosan zu erreichen.

Unsere Experimente deuten stark darauf hin, dass NiCNC die negative Wirkung von Krankheitserregern in Weizensämlingen gegen die Fäulniskrankheit aktiv beseitigen könnte. Daher wird die strukturelle Konformation von NiCNC für seine antimykotische Aktivität wichtig. Die Bildung von Nanopartikeln durch die Methode der ionotropen Gelierung ist vorteilhaft, da keine organischen Lösungsmittel verwendet werden und die Verarbeitungsbedingungen mild sind, wodurch nicht einmal eine geringfügige Änderung der Struktur des eingekapselten Arzneimittels möglich ist90. UV-sichtbare Absorptionsspektroskopie zeigte einen charakteristischen Absorptionspeak für NiCNC bei 241 nm im UV-Bereich, der der in früheren Berichten beschriebenen Bildung von Nanopartikeln sehr ähnelt91. Eine kleinere Partikelgröße des Nanopartikels ist aufgrund seiner Fähigkeit zum einfachen Eindringen und der höheren zellulären Aufnahmekapazität von Vorteil92,93. NiCNC-Partikel hatten eine Größe zwischen 300 und 400 nm. Einigen früheren Berichten zufolge reicht eine Partikelgröße unter 500 nm aus, um leicht in die Zellwand des Pilzes einzudringen94,95,96,97. Eine Gruppe von Forschern schlug bereits vor, dass CNPs in Form von Nanoaggregaten verbleiben, wie in Abb. 1f 98 dargestellt. Darüber hinaus zeigte die EDXS-Analyse von NiCNC das Vorhandensein von Ni im Chitosan-Netzwerk, was die Bildung metallischer Nanokomposite durch elektrostatische Wechselwirkungen bestätigte zwischen den Hydroxylgruppen von Chitosan und dem beteiligten Metallsalz. Dieses Strukturmuster von NiCNC wurde bereits in früheren Studien verschiedener Forscher bestätigt99. Die FE-SEM-Analyse ergab Agglomerationen sowohl von CNPs als auch von NiCNC. Dieses besondere Kriterium von CNPs erleichtert die Exposition großer Oberflächen und macht es zu einem Material, das sich leicht adsorbieren lässt100. In ähnlicher Weise zeigte NiCNC gleichmäßig verteilte, hochporöse, agglomerierte Nanopartikel. Diese Agglomerationen oder Bildung von Nanoclustern und die poröse Beschaffenheit von NiCNC machen sie zu nützlichen Biomolekülen mit hervorragenden Adsorptionseigenschaften und verschiedenen anderen Anwendungen im Bereich der Nanomedizin101. Die FT-IR-Analyse zeigte die Beteiligung wesentlicher funktioneller Gruppen, die eine aktive Rolle bei der antimykotischen Aktivität spielen102.

Die Ergebnisse des Zytotoxizitätstests zeigen keinen signifikanten Unterschied bei den erhöhten Konzentrationen von CNPs und NiCNC bis zu 0,25 mg/ml im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle (Abb. 8). Beide Nanopartikel erwiesen sich ab 0,3 mg/ml als zytotoxisch. Ein signifikanter Unterschied im Prozentsatz der Zytotoxizität wurde bei 0,4 mg/ml festgestellt. Der für NiCNC festgestellte erhöhte Prozentsatz an Zytotoxizität ist möglicherweise auf die Beteiligung von Metallionen im Nanopartikel zurückzuführen38. Die Zytotoxizitätsanalyse legt nahe, dass CNPs und NiCNC für ACHN-Zellen bis zu 0,25 mg/ml nicht toxisch sind, wohingegen die bei Weizenkeimlingen gegen F. solani angewandte bioaktive antimykotische Dosimetrie 0,04 mg/ml betrug, was viel weniger als die toxische Dosis ist. Daher ist die angewendete NiCNC-Dosis für menschliche Zellen ungiftig und kann auf landwirtschaftlichen Feldern für weltweit verzehrte Hauptnahrungspflanzen wie Weizen verwendet werden.

Vergleich der Zytotoxizität von CNPs und NiCNC auf ACHN-Zellen von Säugetieren. Die Zelltoxizität wurde anhand des Prozentsatzes der Zytotoxizität bei unterschiedlichen Konzentrationen von CNPs und NiCNC (0,01–0,4 mg/ml) bewertet. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3) ausgedrückt. Das Sternchenzeichen zeigt signifikant unterschiedliche Mittelwerte (p ≤ 0,05) zwischen CNPs und NiCNC-Behandlungen an.

Forscher haben verschiedene Konzepte zur Beschreibung der Wirkungsweise von Chitosan und seinen Derivaten bei der Entfaltung einer antimykotischen Aktivität entwickelt. Sie behaupteten, dass die fungizide Wirkung auf das Zusammenspiel zwischen den positiv geladenen Chitosanmolekülen und den negativ geladenen Zelloberflächenkomponenten der Pilze zurückzuführen sein könnte, was nach einem ionischen Ungleichgewicht zu einer erhöhten Membranpermeabilität führt103. Es wird auch empfohlen, dass Chitosan, wenn es in die Pilzzelle gelangt, mit der DNA interagiert, indem es deren Struktur verändert und so die mRNA- und Proteinsynthese hemmt104. Darüber hinaus verfügt Chitosan über ein ausgezeichnetes Metallbindungsvermögen und ist dafür bekannt, die Metallionen zu chelatisieren, die für das mikrobielle Wachstum unerlässlich sind. Die Amingruppen des polykationischen Chitosan sind für die Aufnahme der Metallionen verantwortlich105. Es wird angenommen, dass das Übergangsmetallion Nickel mit den positiv geladenen Amingruppen des Chitosan eine zentral lokalisierte tetraedrische Gitterstruktur bildet106. Dieser superpositive Metallkern im Chitosan-Netzwerk ist für die fördernde antimykotische Aktivität durch die Auflösung von Nickelionen verantwortlich, die den Elektronentransport in der pathogenen Zelle unterbrechen, was zu einer Membrandestabilisierung, einem Protoplasma-Austritt und anschließendem Absterben der Pilze führt107 (Abb. 9).

Schematische Darstellung des Wirkungsmechanismus von Nickel-Chitosan-Nanokonjugat gegenüber Pilzpathogenen.

Es gibt verschiedene andere Managementstrategien zur Bekämpfung von Fusariumfäule-Infektionen bei Kulturpflanzen. Forscher haben häufig Biokontrollmittel wie Trichoderma sp., Bacillus plumiles und spezifische Streptomyces-Isolate eingesetzt, die das Auftreten von Fäulniserkrankungen um 66–75 % reduzieren108,109. Diese Biokontrollmittel reduzieren die Schädlingspopulation, beseitigen sie jedoch nicht vollständig und fördern auch nicht das Pflanzenwachstum. Darüber hinaus ist die Verwendung essentieller Pflanzenstoffe wie Extrakte aus Azadirachta sp., Zingiber sp. und Pflanzenstoffe auf Senfbasis zeigten eine höhere Wirksamkeit bei der Hemmung des Myzelwachstums von F. solani110. Für den Einsatz vor Ort im großen Maßstab ist jedoch eine vielversprechende Formulierung mit Stabilität und längerer antimykotischer Aktivität erforderlich, insbesondere gegen Ascosporen111. In dieser Hinsicht ist die Verwendung von Nickel-Chitosan-Nanokonjugat vorteilhaft, da es eine größere Kapazität zur Krankheitsreduktion bei verbesserter Keimlingsgesundheit ermöglicht, eine vollständige Ausrottung des Krankheitserregers bei In-vitro-Untersuchungen bewirkt und eine längere antimykotische Aktivität aufrechterhalten kann. Allerdings muss die weitreichende Feldanwendung noch untersucht werden.

CNPs und NiCNC wurden erfolgreich mit der ionotropen Gelierungsmethode synthetisiert und anhand ihrer verschiedenen physiochemischen Eigenschaften charakterisiert. Die Anwendung von NiCNC zeigte potenzielle wachstumshemmende Eigenschaften gegen F. solani und kontrollierte effizient das Auftreten von Fäulniskrankheiten (unter bestimmten Laborbedingungen). Eine NiCNC-Behandlung mit 0,04 mg/ml stoppt das Wachstum der Myzelkolonie vollständig und hemmt die Sporenkeimung und die Konidienbildung. Die Exposition von NiCNC gegenüber den Pilzkonidien führt zu ultrastrukturellen Schäden, die zu nicht lebensfähigen Sporen führen. Die Behandlung mit NiCNC führt zu einem hohen MDA-Gehalt im Erreger, was zu einer erhöhten Lipidperoxidation der Pilze führt. Der Einsatz von CNPs und dem synthetischen Fungizid Mancozeb kann die Fäulniskrankheit nicht wirksam bekämpfen. Unsere Daten deuten darauf hin, dass NiCNC als Antimykotikum bei der Behandlung der durch F. solani verursachten Fäulniskrankheit eingesetzt werden könnte. Die NiCNC-Behandlung erzeugte ein hohes Maß an oxidativem Stress im Erreger, der letztendlich die Ausbreitung des Erregers im Pflanzensystem beendete. Außerdem könnte die Anwendung mit NiCNC möglicherweise den Vitalitätsindex der Sämlinge trotz der Exposition gegenüber biotischem Stress beschleunigen. Die Nickelkonzentration im synthetisierten Konjugat war minimal und erwies sich im Zytotoxizitätstest als ungiftig für den Weizenkeimling und förderte eine gesunde Keimlingskraft. Es sind jedoch weitere Studien erforderlich, um die Wirkung von NiCNC auf Weizenpathogene durch Feldanwendung zu untersuchen.

Die Herstellung von CNPs erfolgte nach der Methode der ionotropen Gelierung38. Kurz gesagt, 0,2 g Chitosan mit niedrigem Molekulargewicht (50.000–190.000 Da; 80 % N-Deacetylierung; Produkt 448.869; Sigma Aldrich, USA) wurden in 1 % (v/v) Essigsäurelösung gelöst und 30 Minuten lang unter kontinuierlichem Rühren belassen . Ein anionisches Salz, Natriumtripolyphosphat (STPP) (Na5P3O10; HSN-Code: 28.353.100; SRL, Indien) mit einer Konzentration von 1 mg/ml (40 ml) wurde tropfenweise unter konstantem magnetischen Rühren in die Chitosanlösung gegeben (REMI Equipments). . Es bildete sich spontan eine trübe Suspension, die zur NP-Bildung führte und einer Zentrifugation bei 10.000 U/min unterzogen wurde. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet des CNP-Gels wurde sonnengetrocknet und zur weiteren Verwendung bei 4 °C gelagert.

NiCNC wurden nach der von Helen & Rani (2016) beschriebenen Methode mit geringfügigen Modifikationen43 hergestellt. Seine Synthese erfolgte durch tropfenweise Zugabe einer 4 %igen wässrigen Lösung von Nickelchlorid (NiCl2. 6H2O; RM760; Himedia, Indien) unter ständigem magnetischem Rühren in eine Chitosanlösung. Die Lösung wurde 15 Minuten lang bei 120 °C unter Rückfluss erhitzt. Dazu wurden 0,05 M Ascorbinsäure (C6H8O6; MW 176,12; CMS1014; Himedia, Indien) gegeben, gefolgt von der Zugabe von 2 ml 0,6 M NaOH. Nach weiterem Rühren für 30 Minuten wurden 0,5 ml Phenylhydrazin (C6H6N2Cl2.HCl; RM9448; Himedia, Indien) zu der Lösung gegeben. Die Reaktion wurde durch tropfenweise Zugabe von STPP unter ständigem Rühren und anschließende Zentrifugation bei 10.000 U/min für 10 Minuten weiter durchgeführt. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet wurde als Gel erhalten.

Die spektrale UV-Vis-Absorption von CNPs und NiCNC wurde mit einem UV-Vis-Spektrophotometer (Aligent Technologies, Carry 100 UV-Vis) mit einem Scanbereich von 200–800 nm Wellenlänge erfasst. Die Morphologie von CNPs und NiCNC wurde mittels HR-TEM untersucht, das auf einem JEOL JEM 2100F mit einer Vergrößerung von 50x – 1,5 Mx und einem Beschleunigungspotential von 200 kV durchgeführt wurde. Die Oberflächentopographie der Nanopartikel wurde mit dem Schottky-Feldemissions-Rasterelektronenmikroskop (FE-SEM) JSM-7900F untersucht. JEOL, 0,1–30 kV. Das Vorhandensein von Elementen bis hin zu Bor, insbesondere für NiCNC, wurde ebenfalls mithilfe von EDXS bestimmt. Die in den Nanopartikeln vorhandenen funktionellen Gruppen wurden durch FT-IR-Analyse im Scanbereich von 500–4000 cm−1 unter Verwendung der KBr-Pellet-Technik nachgewiesen. Vor der Durchführung der FT-IR-Analyse wurden die Nanopartikel sonnengetrocknet und mit einem Mörser zu feinem Pulver zermahlen. Während der Analyse wurden 300 mg getrocknetes KBr zerkleinert und mit 2 mg zuvor getrockneter Nanopartikel gemischt und in einen fettfreien Probenbecher gegeben. Eine homogene Mischung aus KBr und Nanopartikeln wurde hergestellt und für die Spektralanalyse der Probe verwendet.

Zur Isolierung des Zielpathogens wurden erkrankte Sämlinge mit typischen Symptomen von Stängel- und Fußfäule von Weizen auf Weizenanbaufeldern in Nordbengalen, Indien, gesammelt. Für das Sammeln erkrankter Pflanzenteile wurden von den Landwirten Genehmigungen eingeholt. Erkrankte Stängel von etwa 1 cm Länge wurden herausgeschnitten, oberflächensterilisiert und in sterile Petrischalen gegeben, die 20 ml autoklaviertes Kartoffel-Dextrose-Agar-Medium (PDA) enthielten. Die Platten werden 7 Tage lang bei 28 °C inkubiert. Nach 7 Tagen wurde das Isolat mehrmals subkultiviert, um Platten mit Reinkultur zu erhalten. Die Reinkultur wurde zur Identifizierung an das IARI (Indian Agricultural Research Institute, Neu-Delhi, Indien) geschickt und der Erreger wurde als Fusarium solani (ID-Nr. 11116.19) gemeldet. Die Reinkulturen wurden zur weiteren Verwendung in Experimenten in PDA-Schrägen bei 28 °C gehalten112.

Die antimykotischen Aktivitäten von CNPs und NiCNC auf das radiale Myzelwachstum von F. solani wurden durch die Technik vergifteter Lebensmittel bestimmt38. Eine Reihe von Konzentrationen (0,001, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04 mg/ml) von CNPs und NiCNC wurden mit 20 ml autoklaviertem Kartoffel-Dextrose-Agar (PDA)-Medium gemischt. Eine Myzelscheibe mit einem Durchmesser von 5 mm wurde mit einem scharfen und sterilen Korkbohrer aus einer 7 Tage alten, sporulierten Kultur von F. solani herausgeschnitten, die auf PDA-Medium gezüchtet und in der Mitte jeder Behandlungsplatte ausgesät wurde. Jede Behandlungsplatte wurde anhand von drei Replikaten angefertigt. Zum Vergleich aller Behandlungen wurde eine mit dem handelsüblichen Fungizid Mancozeb behandelte Platte in der kommerziell empfohlenen Dosis (16 mg/ml)113 und eine Platte ohne jegliche Behandlung vorbereitet. Die Platten wurden 7 Tage lang bei 28 °C inkubiert. Das radiale Wachstum der Pilzkolonie wurde täglich überwacht, bis die am schnellsten wachsende Kolonie den gesamten Durchmesser der Platte bedeckt hatte. Die Hemmung des Pilzwachstums wurde anhand der folgenden Formel berechnet und als prozentuale Hemmung des radialen Wachstums (PIRG)38 ausgedrückt:

Die Aktivität von CNPs und NiCNC auf die Hemmung der Sporenkeimung wurde mithilfe der Konkavitätsschiebermethode bewertet. Eine Konidiensuspension wurde durch Eingießen von 10 ml sterilem destilliertem Wasser in die 7 Tage alten Kulturröhrchen mit Sporenbildung und leichtes Schütteln und anschließendes Filtrieren der Suspension mit einem Käsetuch hergestellt. Dann wurden 150 µL Konidiensuspension mit dem gleichen Volumen an CNPs und NiCNC in unterschiedlichen Konzentrationen wie im vorherigen Experiment gemischt. Ein ähnlicher Aufbau wurde auch mit 16 mg/ml Mancozeb hergestellt. Etwa 60 µL des Hybrids mit etwa 1,0 × 106 Konidien/ml wurden auf den Objektträger gegeben und 6 Stunden lang bei 28 °C in einer feuchten Kammer inkubiert. Nach 6 Stunden wurden die Konidien unter einem Lichtmikroskop (Magnus, ch-20i, Olympus) untersucht. Die Gesamtzahl der gekeimten Sporen wurde aus der Gesamtzahl der in sechs zufällig ausgewählten Bereichen des Objektträgers vorhandenen Sporen unter dem Mikroskop gezählt. Die Hemmung der Sporenkeimung in % wurde anhand der folgenden Formel112 berechnet:

Die Wirkung von CNPs und NiCNC auf die Unterdrückung der Sporulation wurde unter Verwendung eines geeigneten sporulationsinduzierenden Mediums, d. h. Czapek-Dox-Agar-Medium, untersucht, das mit CNPs und NiCNC-Lösungen gemischt wurde, um eine Endkonzentration von 0,001, 0,01, 0,02, 0,03 und 0,04 mg/ml zu erhalten. Die Konzentrationen wurden mit einer Blindprobe und Mancozeb verglichen. Nach vollständiger Sterilisation wurden 4 ml des Hybrids in die Petrischale gegossen und abkühlen gelassen. Anschließend wurde ein Pilzinokulum mit einem Durchmesser von etwa 0,5 cm aseptisch in das behandelte Medium überführt. Die Platten wurden 72 Stunden lang bei 28 °C inkubiert. Die Sporendichte für jede Behandlung wurde mit einem Hämozytometer unter einem Lichtmikroskop gemessen71.

Zur quantitativen Abschätzung lebensfähiger Sporen wurde ein kolorimetrischer Test mit XTT 2,3-Bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-tetrazoliumhydroxid durchgeführt (TC239, Himedia, Indien). Dieser Assay beinhaltet auch ein Elektronenkopplungsmittel Menadion (CAS-Nr. 58-27-5, Sigma Aldrich, USA). Kurz gesagt, eine Sporensuspension (1,0 × 106 Konidien/ml) wurde in Czapeck-Flüssigmedium hergestellt und 100 µL der Suspension wurden in einer 96-Well-Mikroplatte mit flachem Boden 4 Stunden lang bei 28 °C kultiviert. Nach der Inkubation wurden 100 µL beider Nanopartikel in unterschiedlichen Konzentrationsbereichen (0,001, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04 mg/ml) zur Suspension gegeben und erneut für weitere 4 Stunden bei derselben Temperatur inkubiert. Der Suspension wurden 50 µL XTT-Lösung mit einer Konzentration von 400 µg zusammen mit 7 µL Menadion (25 µM) zugesetzt. Die Mikroplatten wurden 3 Stunden lang bei 28 °C inkubiert und die optische Dichte wurde bei 450 nm gemessen114.

Die Wirkung der oben genannten Konzentrationen von CNPs und NiCNC auf die Lipidperoxidation der Pilze wurde durch die quantitative Schätzung von Malondialdehyd (MDA), einem Indikator für Lipidperoxidation, bestimmt. Die mit Nanopartikeln behandelte Myzelmatte wurde nach 7 Tagen Inkubation bei 28 °C geerntet. Die Myzelmatte wurde gründlich mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen und dann mit Löschpapier getrocknet. 2 g des Myzels wurden mit 10 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) in einem vorgekühlten Mörser und Stößel kalt homogenisiert. Dieses Homogenat wurde 12 Minuten lang bei 10.000 U/min kalt zentrifugiert. Der zellfreie Überstand wurde zur MDA-Schätzung verwendet. 100 µL des Homogenats wurden mit 3 ml einer 0,335 %igen (Gew./Vol.) Thiobarbitursäurelösung (Himedia, Indien) gemischt, die 10 % (Gew./Vol.) Trichloressigsäure (Himedia, Indien) enthielt. Die Mischung wurde 15 Minuten lang einem siedenden Wasserbad ausgesetzt. Der MDA-Gehalt wurde im Spektrophotometer 169 (Systronics) bestimmt und mit einem molaren Absorptionskoeffizienten von 1,56 × 105 bei 530 nm115 berechnet.

Der oxidative Stresstest wurde durchgeführt, um die Menge an ROS zu ermitteln, die in Pilzhyphen als Folge der CNPs- und NiCNC-Behandlung produziert wird. In diesem Experiment wurde ein typisches zelldurchlässiges, unpolares, nicht fluoreszierendes Sondenmolekül 2',7'-Dichlordihydrofluoresceindiacetat (H2DCFH-DA) (D6665; Sigma Aldrich, USA) verwendet. Wenn dieses hydrophobe Molekül in die Zelle gelangt, wird es durch intrazelluläre Esterasen zu 2',7'-Dichlordihydrofluorescein (DCFH) deacetyliert. DCFH wird durch ROS oxidiert, die in der Zelle infolge der Stresserzeugung aufgrund der Exposition gegenüber Nanopartikeln produziert werden. DCFH wandelt sich in Dichlorfluorescein (DCF) um, das bei Anregung eine nachweisbare grüne Fluoreszenz erzeugt. Die Pilzhyphen wurden in Kartoffel-Dextrose-Brühe (PDB), die CNPs enthielt, und einer NiCNC-Behandlung mit 0,04 mg/ml und 16 mg/ml Mancozeb für 72 Stunden bei 28 °C kultiviert. Nach 72 Stunden wurden die Hyphen durch 10-minütige Zentrifugation bei 10.000 U/min gesammelt. Das Medium wurde mit dem Überstand verworfen. Die Hyphenzellen wurden dreimal mit Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und die Hyphen darin suspendiert gehalten. Die Hyphensuspension wurde in einer dunklen Kammer mit 40 µL H2DCFH-DA gemischt. Die Behandlungen wurden 2 Stunden lang im Dunkeln bei 28 °C unter periodischem Schütteln inkubiert. Schließlich wurde die Erzeugung von ROS visuell unter einem Fluoreszenzmikroskop (Nikon Eclipse E200, Nikon, Tokio, Japan) mit einem Anregungsfilter bei 485 nm und einem Emissionsfilter bei 525 nm71 beobachtet.

Die morphologischen Veränderungen in der Pilzspore als Folge der CNPs- und NiCNC-Behandlung bei 0,04 mg/ml und Mancozeb bei 16 mg/ml wurden unter dem Rasterelektronenmikroskop (REM) (JSM-IT 100; JEOL) beobachtet. Die Pilzsporen im PDB wurden mit Nanopartikeln behandelt und 72 Stunden lang inkubiert. Die Pilzkonidien wurden vor der mikroskopischen Untersuchung einer Vorbehandlung unterzogen116.

Um die Fähigkeit von CNPs und NiCNC bei der Reduzierung des Auftretens von Fäulniskrankheiten zu bewerten, wurde ein Versuch durchgeführt. Für das Experiment wurde eine Brotweizensorte (Triticum aestivum L.) (PBW 343) verwendet, die von der National Seed Corporation of India Ltd. gesammelt wurde. Alle Pflanzenexperimente entsprachen den relevanten institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien und Gesetzen. Der isolierte F. solani wurde als Inokulum für die künstliche Inokulation der Sämlinge verwendet, um bei sich entwickelnden Sämlingen Symptome von Stängel- und Fußfäule zu erzielen. Die Konzentration des Inokulums betrug 106 Konidien/ml. Die künstliche Inokulation des Erregers erfolgte durch Wurzelbestrahlung. Kurz gesagt, 5 ml Konidiensuspension wurden rund um die Stammbasis von 4 Tage alten Sämlingen gegossen. Nach 24-stündiger Inokulation wurde das gleiche Volumen von 0,04 mg/ml CNPs und NiCNC nach demselben Verfahren wie oben aufgetragen. Sämlinge wurden in Kunststoffschalen (14 × 30 × 7 cm) gezüchtet, die 5 kg Erde, gemischt mit Vermiculit im Verhältnis 1:1, enthielten. Die Behandlungen wurden wie folgt kategorisiert: Unbehandelte, mit CNPs (0,04 mg/ml) und NiCNC (0,04 mg/ml) und Mancozeb (16 mg/ml) behandelte Sämlinge. Jede Behandlung wurde wiederum in einen mit F. solani inokulierten und einen nicht inokulierten Satz unterteilt. Für jeden Satz wurden 30 Setzlinge in gleichen Abständen in die Schalen gesät. Der Versuch war auf 20 Tage angelegt und es wurde regelmäßig gegossen. Nach Ablauf von 20 Tagen wurden für jede Pflanze Symptome für durch F. solani verursachte Fäulnis auf der Grundlage einer von Santori und Infantino (2009)117 vorgeschlagenen 5-Stufen-Skala erfasst: 0 = Symptome fehlen; 1 = leichte dunkelbraune Färbung an der Wurzel bzw. Fußbasis; 2 = dunkelbraune Färbung auf fast der Hälfte des Stängels oder der Wurzel; 3 = Stängel oder Wurzel völlig dunkelbraun; 4 = Absterben der gesamten Pflanze. Die gesammelten Daten wurden zur Bewertung des Krankheitsindex118 in die McKinney-Formel (1923) eingefügt.

wobei Fk = Anzahl der infizierten Sämlinge in der Behandlungsfläche (gemäß einer 5-stufigen Skala); n entspricht der Gesamtzahl der bewerteten Sämlinge (n = 30); xk entspricht der Gesamtzahl der infizierten Sämlinge aus der Kontrollanordnung.

Auch die Krankheitshäufigkeit der Sämlinge wurde anhand des Experiments bewertet119.

Die morphologische Vitalität der behandelten Sämlinge wurde unter Verwendung der folgenden Vitalitätsindexformel120 analysiert

Stressindizes der behandelten Sämlinge wurden berechnet, um die Wirkung der CNPs- und NiCNC-Behandlung bei der Abschwächung von pathogenem Stress auf die Vitalität der Sämlinge zu bewerten121.

Die menschliche Nierenzelllinie (ACHN) wurde vom National Center for Cell Science (NCCS), Pune, Indien, bezogen. Die Zytotoxizität wurde mithilfe des MTT-Assays (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid) untersucht122,123. Eine sich schnell vermehrende menschliche Nierenzelllinie wurde in einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen bei 37 °C in Gegenwart von 5 % CO2 in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) ausgesät. Zellkulturmedium Ham F-12 mit einer Dichte von 6 × 103 Zellen/ Also. Nach 24 Stunden, als die Zellen eine signifikante Konfluenz erreichten, wurden in jede Vertiefung CNPs und NiCNC-Nanopartikel in unterschiedlichen Konzentrationen im Bereich von 0,01–0,4 mg/ml in dreifacher Ausfertigung gegeben. Die behandelten Platten wurden unter den gleichen Bedingungen 24 Stunden lang weiter inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Platten aus dem Inkubator entnommen und das Zellkulturmedium abgesaugt. In jede Vertiefung wurden 10 µL MTT, gelöst in 1X PBS, gegeben und die Platte erneut 3 Stunden lang unter den oben genannten Bedingungen gehalten. Schließlich wurden 50 µl Isopropanol in jede Vertiefung mit MTT-Lösung gegeben und etwa 10 Minuten lang geschüttelt. Die Absorption wurde bei 620 nm in einem ELISA-Lesegerät aufgezeichnet.

Der Prozentsatz der Zelltoxizität wurde als [(C−T)/C × 100] berechnet, wobei „C“ die mittlere optische Dichte der Kontrolle (unbehandelte Zellen) und „T“ die mittlere optische Dichte behandelter Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen ist von Nanopartikeln.

Alle aus den durchgeführten Experimenten erhaltenen Daten wurden als Mittelwert von sechs verschiedenen Beobachtungen mit Standardabweichung (SD) (Mittelwert ± SD) dargestellt. Statistische Unterschiede wurden mithilfe des Duncan-Multiple-Range-Tests (DMRT) bei p ≤ 0,05 (DSAASTAT Version 1.022) analysiert, wobei die Behandlungen, die sich signifikant unterschieden, durch die Buchstaben a, b, c usw. gekennzeichnet wurden. Statistische Analyse der Keimungsparameter zwischen den Inokulierten und nicht inokulierte Sämlinge wurden unter Verwendung eines ungepaarten zweiseitigen t-Tests durchgeführt, um den signifikanten Unterschied zwischen den verschiedenen Behandlungen mithilfe der GraphPad Prism-Software Version zu ermitteln. 6 für Windows (GraphPad Software, Inc. USA) bei p < 0,05.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien enthalten.

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Die Autoren möchten der University Grant Commission (indische Regierung) für die Unterstützung der Grundlagenforschung danken, da der Erstautor ein UGC-NET JRF-Stipendium erhält. Die Autoren danken auch National Seeds Corp. Ltd., SAIF-IIT Bombay, CIF-LPU (Indien) und der Abteilung für Zoologie (Universität Nordbengalen, Indien) für ihre Zusammenarbeit.

Palash Mandal ist verstorben.

Labor für Nanobiologie und Phytotherapie, Abteilung für Botanik, University of North Bengal, Darjeeling, WB, 734013, Indien

Divya Chouhan & Palash Mandal

ANMOL-Labor, Abteilung für Biotechnologie, University of North Bengal, Darjeeling, WB, 734013, Indien

Ankita Dutta und Anoop Kumar

Abteilung für Botanik, North Bengal St. Xavier's College, Jalpaiguri, WB, 735134, Indien

Chandrani Choudhury

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DC – Methodik, Validierung, formale Analyse, Datenkuration, Schreiben – Originalentwurf, Visualisierung. AD – Zytotoxizitätsanalyse: Methodik und Validierung. AK – Zytotoxizitätsanalyse: Konzeptualisierung und Überwachung. PM – Konzeptualisierung, Supervision, Projektadministrator, Schreiben und Bearbeiten. CM – Konzeptualisierung, Supervision, Projektadministrator. Die Abbildungen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 und 9 wurden von DC erstellt, mit Ausnahme von Abb. 8, die von AD erstellt wurde. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Chandrani Choudhury.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Chouhan, D., Dutta, A., Kumar, A. et al. Anwendung von Nickel-Chitosan-Nanokonjugat als Antimykotikum zur Bekämpfung der Fusariumfäule von Weizen. Sci Rep 12, 14518 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-18670-2

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Eingegangen: 23. März 2022

Angenommen: 17. August 2022

Veröffentlicht: 25. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-18670-2

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