Zeitlich aufgelöstes SMLM (mit großer PAR-Verschiebung) ermöglichte die Visualisierung der dynamischen HA-Clusterbildung und -Migration in einer lebenden Zelle

Jul 23, 2023

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 12561 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Die Blinkeigenschaften eines einzelnen Moleküls sind entscheidend für die Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie (SMLM). Typischerweise umfassen SMLM-Techniken die Aufzeichnung mehrerer Bilder beugungsbegrenzter heller Flecken einzelner Moleküle mit einer Detektorbelichtungszeit nahe der Blinkperiode. Dies begrenzt die zeitliche Auflösung von SMLM auf einige zehn Millisekunden. Wir sind uns bewusst, dass ein erheblicher Anteil einzelner Moleküle Photonen für viel kürzere Zeitskalen als die durchschnittliche Blinkperiode emittiert. Daher schlagen wir eine beschleunigte Datenerfassung vor, um diese schnellen Emitter zu erfassen. Hier stellen wir eine auf kurzer Belichtung basierende SMLM-Methode (shortSMLM) vor, die auf einem sCMOS-Detektor basiert, um dynamische Ereignisse (sowohl auf Einzelmolekül- als auch auf Ensembleebene) zu verstehen. Die Technik wird an einem Influenza-A-Krankheitsmodell demonstriert, bei dem NIH3T3-Zellen (sowohl fixierte als auch lebende Zellen) mit Dendra2-HA-Plasmid-DNA transfiziert wurden. Die Analyse zeigt eine 2,76-fache Verbesserung der zeitlichen Auflösung, die mit Einbußen bei der räumlichen Auflösung einhergeht, und eine PAR-Verschiebung der Partikelauflösung (in Bezug auf die Lokalisierungsgenauigkeit) von \(\sim\) 11,82 nm im Vergleich zum Standard-SMLM. Wir haben die dynamische HA-Clusterbildung in transfizierten Zellen nach 24 Stunden DNA-Transfektion visualisiert. Es wird darauf hingewiesen, dass eine Verringerung der räumlichen Auflösung die Clustereigenschaften (Clusterdichte, \(\#\) Moleküle/Cluster, Clusterverbreitung usw.) nicht wesentlich verändert und tatsächlich kritische Merkmale bewahrt. Darüber hinaus zeigt die Zeitrafferaufnahme die dynamische Bildung und Migration von Hämagglutinin (HA)-Clustern in einer lebenden Zelle. Dies legt nahe, dass die Verwendung eines synchronisierten sCMOS-Detektors mit hoher QE (betrieben bei kurzen Belichtungszeiten) hervorragend für die Untersuchung der zeitlichen Dynamik im zellulären System geeignet ist.

In der Regel werden Standardtechniken der Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie (SMLM) (fPALM1, STORM2, PALM3, IML-SPIM4, MINFLUX5,6, dSTORM7, SOFI8, ROSE9, SMILE10,11, POSSIBLE12 und Varianten 13,14,15,16,17) angewendet mehrere tausend (\(> 10^{3}\) ) Bilder einzelner Moleküle, um ein einziges superaufgelöstes Bild zu rekonstruieren. Dies führt zu einer erheblich längeren Aufnahmezeit als die typischen Belichtungs- und Auslesezeiten der Kamera. Um die zeitliche Gesamtauflösung zu beschleunigen, muss die Datenerfassung beschleunigt werden. Aufgrund der Fluoreszenzzykluszeit eines Moleküls gibt es jedoch eine Grenze für die zeitliche Auflösung18. In jüngster Zeit gab es nur wenige Studien mit schnell blinkenden Molekülen, hoher Anregungsintensität, dunklen Zuständen und einer sCMOS-Kamera19,20,21,22,23. In anderen Studien hat sich die Verkürzung der Erfassungszeit mithilfe rechnerischer Techniken als vielversprechend erwiesen. Andere Techniken, einschließlich der Verwendung schneller Rechenmaschinen (FPGA-GPU und CUDA) in Verbindung mit künstlicher Intelligenz, haben großes Potenzial in SMLM24,25,26,27 gezeigt. Obwohl diese Techniken hilfreich sind, sind sie anfällig für Photobleichung. Hier diskutieren wir die schnelle Datenerfassung mithilfe der fortschrittlichen sCMOS-Technologie zur Erfassung schnell blinkender fluoreszierender Proteine ​​(Dendra2). Das Blinkverhalten von Dendra2 zusammen mit den EIN/AUS-Zeiten wurde von Avilov et al.28 im Detail untersucht. Es wird erwartet, dass schnelle Aufnahmetechniken zusammen mit schnellen Rechenmaschinen eine beeindruckende Kombination darstellen und mit größerer Wahrscheinlichkeit hochauflösende Bildgebung in Echtzeit ermöglichen.

In den letzten Jahren gab es erhebliche Fortschritte in dieser Richtung und viele Forschungsgruppen haben sich mit diesem Thema befasst. Ein besonderer Ansatz besteht darin, die Anzahl aktiver Einzelmoleküle pro Frame zu erhöhen, ohne die Intensität und andere experimentelle Parameter zu ändern21,29. Allerdings ist diese Technik mit Kosten verbunden, da eine große Aktivierung zu einer Überlappung der beugungsbegrenzten Signaturen einzelner Moleküle führen kann, was dazu führt, dass einzelne Moleküle nicht mehr unterscheidbar sind, was wiederum die Komplexität erhöht30. Aktuelle Arbeiten von Lin et al. verglichen quantitativ die Bildqualität für Mikrotubuli, die mit Alexa Fluor 647-Farbstoff immunmarkiert wurden19. Eine weitere Studie von Diekmann et al. zeigte, dass zwei kritische Faktoren (d. h. Lokalisierungsgenauigkeit und Etikettierungseffizienz) die SMLM-Bildqualität bestimmen. Sie untersuchten systematisch die Auswirkung der Geschwindigkeit auf die Bildqualität für verschiedene Farbstoffe (AF647, CF680, CF660C, Dy634) bei unterschiedlichen Markierungseffizienzen und -intensitäten21. Nach unserem Kenntnisstand wurden photoschaltbare Proteine ​​wie Dendra 2 noch nie für die schnelle Bildgebung und Zeitraffer-Lokalisierungsmikroskopie demonstriert und stellen daher eine wichtige Klasse von Sonden dar, die in der hochauflösenden Mikroskopie verwendet werden. Insbesondere ermöglichen photoschaltbare Proteine ​​die Klonierung/Konjugation mit dem Protein von Interesse, was sie für die Untersuchung biologischer Prozesse (z. B. Krankheitsverlauf31,32,33) geeignet macht und zum Verständnis des zugrunde liegenden Mechanismus beiträgt.

Eine neuere Technik, die auf Deep Learning basiert, schlägt vor, die Zeit nach der Erfassung zu beschleunigen, ohne die räumliche Auflösung in 2D oder die 3D-Lokalisierung jedes blinkenden Moleküls pro Frame zu beeinträchtigen34,35. Eine weitere Technik, die eine Verbesserung der zeitlichen Auflösung verspricht, ist ein auf der sCMOS-Technologie basierendes Erfassungsgerät, das die EMCCD-Technologie übertrifft, indem es die Auslesezeit verkürzt, ohne Kompromisse bei der Quanteneffizienz einzugehen21,27. Eine aktuelle dSTORM-Bildgebung fixierter Zellen mit einer sCMOS-Kamera mit Alexa 647-Farbstoff als Sonde hat Potenzial für schnelles SMLM36 gezeigt. Darüber hinaus wird die STORM-Bildgebung auch bei niedrigen bis hohen Geschwindigkeiten durchgeführt, um eine optimale Auflösung und Bildqualität zu gewährleisten21,37.

Im Allgemeinen erfordert die Untersuchung komplexer biologischer Prozesse eine schnelle Datenerfassung. Dies hat viele Vorteile, einschließlich der Beobachtung von Dynamiken im Millisekunden-/Submillisekundenbereich und einer erheblichen Reduzierung langer Erfassungszeiten. Diese Faktoren haben Auswirkungen auf das Signal-Rausch-Verhältnis, den Bildhintergrund und die Systemdrift. Hier berichten wir über eine einfache Methode, die durch Verkürzung der Datenerfassungszeit bei herkömmlichen Einzelmolekül-Detektionsarchitekturen implementiert wird, um die Engpässe zu überwinden, die bei vielen biophysikalischen Prozessen auftreten, die in schnelleren Zeitskalen ablaufen. Insbesondere untersuchen wir HA-Cluster und die damit verbundenen dynamischen Veränderungen im Laufe der Zeit in einer zellulären Umgebung. Um dies zu realisieren, wird eine Erfassungsmethode mit kurzer Belichtungszeit (\(\sim 5~{\text {ms}}\)) (angetrieben durch einen sCMOS-Detektor) vorgeschlagen. Ziel ist es, den Einfluss der kurzen Belichtungszeit auf die Lokalisierungsgenauigkeit und deren Auswirkungen auf die Clusteranalyse zu verstehen und zu bewerten. Insgesamt verbessert die Methode die zeitliche Auflösung auf Kosten der Lokalisierungsgenauigkeit und bewahrt gleichzeitig biophysikalische Parameter im Zusammenhang mit der Clusterbildung (z. B. Clusterdichte, \(\#\) Moleküle/Cluster, Clusterverbreitung usw.).

Wichtiges Hardwaresystem, das am SMLM-Datenerfassungsprozess beteiligt ist. Die für eine Einzelbilderfassung benötigte Zeit ist die Summe der Zeit, die jedes Subsystem für den Datenerfassungsprozess benötigt. „Lesen/Schreiben“ wird hier mit r/w abgekürzt.

Superaufgelöstes Bild von HA-Molekülen 24 Stunden nach transienten D2HA-transfizierten NIH3T3-Zellen für 5 ms, 30 ms und 50 ms, belichtet mit Zyla 4.2 plus (Andor). Bei der Datenerfassung wird \(2\times 2\)-Binning verwendet. Jedes rekonstruierte Bild enthält etwa 20.000 HA-Moleküle. Entsprechende Transmissions- und Fluoreszenzbilder (bei 510 nm) werden ebenfalls gezeigt.

Die Lokalisierungspräzisionsdiagramme der rekonstruierten Bilder, die sowohl für Vorwärts- (\(5~{\text {ms}} - 30~{\text {ms}} - 50~{\text {ms}}\)) als auch für Rückwärts- ( \(50~{\text {ms}} - 30~{\text {ms}} - 5~{\text {ms}}\)) Schemata. Die entsprechenden Balkendiagramme für die Lokalisierungsgenauigkeit für Vorwärts- und Rückwärtsfälle sowie die Partikelauflösungsverschiebung (PAR-Shift) werden ebenfalls angezeigt.

(A–C) Zerlegte (unter Verwendung der K-Medoid-Methode) superaufgelöste Bilder von HA-Molekülen, die in der Zelle verteilt sind, für Aufzeichnungen bei \(5~{\text {ms}}\), \(30~{\text {ms }}\) und \(50~{\text {ms}}\). (D–F) Die entsprechenden Parameter wie \(\#~Moleküle\), Fläche und Dichte pro Partition werden ebenfalls geschätzt. (G, H) Die Schwerpunkte und die Verteilung der Partitionen sowie die paarweise (\(50 \& 5\), \(30 \& 5\) und \(30 \& 50\)) Änderung dieser Parameter sind ebenfalls vorhanden anhand von Balkendiagrammen dargestellt.

(A–C) DBSCAN schätzte Molekülcluster für Daten, die bei kurzer Belichtungszeit zusammen mit Standard-SMLM und langer Belichtungszeit (\(50~{\text {ms}}\)) erhalten wurden. (D) Eine Überlagerung der geclusterten Lokalisierungen, farbcodiert durch die Integrationszeit. (E) Die Diagramme zeigen den Durchschnittswert der geschätzten biophysikalischen Parameter (Anzahl der HA-Moleküle pro μm2, Anzahl der Moleküle pro Cluster (\(\# N / C\)), Clusterfläche (μm2) und Clusteranteil \(\sum _i C_i / C_A\) ) relevant für gebildete Molekülcluster, wobei \(C_i\) und \(C_A\) der gesamten Clusterfläche bzw. der Zellfläche entsprechen.

Zeit pro Bild und Lokalisierungspräzisionsdiagramme. Es ist offensichtlich, dass ein Anstieg der zeitlichen Auflösung zu einer schlechten räumlichen Auflösung führt und umgekehrt (siehe schwarze Kurve). Die rote Kurve (tatsächliche Integrationszeit) entspricht der Zunahme der Zeit pro Bild mit der Belichtungszeit gemäß dem Schema in Abb. 1.

Live-Zellbildgebung von Dendra2-HA-transfizierten Zellen. Nicht gruppierte Moleküle werden zur weiteren Analyse aus den Bildern entfernt. Neben der Lokalisierung wird auch Präzision gezeigt. Die Daten werden basierend auf der Zeiterfassung in 5 Teile (A–E) unterteilt (0–8 Min., 9–16 Min., 17–24 Min., 25–32 Min., 33–40 Min.). Daneben wird auch die Überlagerung des gesamten Bildes (nach Zeitpunkten) angezeigt. (F) Die Lokalisierungsgenauigkeit im Vergleich zur Zeit wird zusammen mit dem Fluoreszenzbild der transfizierten Zelle ebenfalls angezeigt.

Die vorgeschlagene Technik wird eingesetzt, um die zeitliche Auflösung von Standard-SMLM zu verbessern, indem die Belichtungszeit des Detektionsgeräts (sCMOS-Kamera) reduziert wird. Dies basiert auf der Annahme, dass ein erheblicher Teil der Moleküle kürzer als die durchschnittliche Blinkdauer (\(30~{\text {ms}}\))38,39,40 blinkt. Unser Ansatz besteht darin, diese schnell blinkenden Moleküle mit einer Lebensdauer von weniger als \(\le 5~{\text {ms}}\)1 einzufangen. Bei der vorliegenden Technik wird die sCMOS-Kamera mit kurzen Belichtungszeiten für schnelle Bildraten betrieben. Dies hilft bei der Erfassung schnell blinkender Moleküle. Ein schematisches Diagramm mit Erfassungsdetails für das \(Kurz-SMLM\)-System und dessen Vergleich mit Standard-SMLM ist in Abb. 1 dargestellt.

Abbildung 2 zeigt die rekonstruierten superaufgelösten Bilder der mit Dendra2-HA transfizierten NIH3T3-Zelle (siehe Transmissionsbild). Das Transfektionsprotokoll und die Zellkulturbedingungen werden im Abschnitt „Methoden“ detailliert beschrieben. Um den Einfluss der Detektorbelichtungszeit auf die Signaturen einzelner Moleküle zu charakterisieren, haben wir Bilder mit aufsteigender Reihenfolge \(5~{\text {ms}},~30~{\text {ms}}, 50~{\text {ms) gesammelt }}\), wie in Abb. 2 gezeigt. Insgesamt werden 20.000 Moleküle aus etwa 5.000 Bildern erkannt. Die entsprechenden Lokalisierungsdiagramme sind in Abb. 3 dargestellt. Die Diagramme zeigen eine Verringerung der Lokalisierungsgenauigkeit mit abnehmender Belichtungszeit, was auf eine geringere Anzahl detektierter Photonen pro Molekül zurückzuführen ist. Insbesondere stellen wir eine PAR-Verschiebung von \(11,86~{\text {nm}}\) im Vergleich zum Standard-SMLM fest. Wenn das gleiche Experiment in absteigender Reihenfolge wiederholt wird, setzt sich der Trend fort, obwohl sich die durchschnittliche Lokalisierung etwas ändert und eine PAR-Verschiebung von \(10,19~{\text {nm}}\) festgestellt wird. Dies deutet darauf hin, dass ein Einbußen bei der Lokalisierungsgenauigkeit zu einer Verbesserung der zeitlichen Auflösung führt. Die Belichtungszeit hat Einfluss auf die Lokalisierungsgenauigkeit. Dies deutet auf eine PAR-Verschiebung in Richtung Beugungsgrenze im Vergleich zum Standard-SMLM und darüber hinaus (bei \(50~{\text {ms}}\)) hin. Insgesamt wurde während der Experimente eine durchschnittliche PAR-Verschiebung (in Bezug auf die Lokalisierungsgenauigkeit) von \(11,86~{\text {ms}}\) festgestellt.

Um auf die Auflösung rekonstruierter Bilder zuzugreifen, haben wir eine Fourier-Ring-Korrelationsanalyse (FRC)41,42 durchgeführt. FRC wird anderen Metriken vorgezogen, da keine Vorabinformationen erforderlich sind und die Metrik in Echtzeit berechnet werden kann. FRC basiert auf der Tatsache, dass jedes System über eine effektive Grenzfrequenz verfügt und die Auflösung durch die vom System unterstützten hohen Ortsfrequenzen bestimmt wird. Abb. S4-1 zeigt die FRC-Analyse für 5 ms, 30 ms und 50 ms, für die die entsprechenden FIRE-Werte 60,36 nm, 93,99 nm bzw. 98,43 nm betragen. Es wird ein Standardschwellenwert von \(1/7=0,143\) gewählt. Die Ortsfrequenz, bei der die FRC unter den Schwellenwert fällt, wird als Grenzfrequenz definiert und die Auflösung wird berechnet. Eine detaillierte Analyse für beide Fälle finden Sie in Anhang 4.

Um die Auswirkungen einer kurzen Expositionszeit auf die einzelnen Molekülcluster zu verstehen, verwendeten wir unsere Technik zur Visualisierung von Partitionen in Dendra2-HA-transfizierten NIH3T3-Zellen und experimentellen Bedingungen, die hauptsächlich für SMLM verwendet werden. Die Ergebnisse sind in Abb. 4 für das Vorwärtsschema dargestellt, d. h. beginnend mit kurzer (\(5~{\text {ms}}\)) bis langer Belichtung (\(50~{\text {ms}}\)) . Die vollständige Datenerfassung sowohl für Vorwärts- als auch für Rückwärtsmessschemata ist in Ergänzung 1 detailliert beschrieben. Die Schemata werden verwendet, um eine verzerrungsfreie Aufzeichnung und Einheitlichkeit zwischen den Datensätzen bei unterschiedlichen Belichtungszeiten sicherzustellen. Um die Ähnlichkeit sicherzustellen, haben wir eine K-mediod-basierte unbeaufsichtigte Segmentierung43 verwendet und die zugehörigen Parameter (Schwerpunkt, Ausbreitung und Größe (Fläche) der Partition) geschätzt. Anhand der Einzelmolekülkarten (mit durch verschiedene Farben gekennzeichneten Partitionen und ihren Schwerpunkten) kann die Konsistenz visuell festgestellt werden (siehe Abb. 4A – C). Darüber hinaus werden auch entsprechende Parameter in Bezug auf die Anzahl der Moleküle, die Fläche und die Dichte der Partitionen geschätzt (siehe Abb. 4D – F). Diese Parameter deuten auf eine verzerrungsfreie Datenerfassung bei unterschiedlichen Belichtungszeiten sowohl für Vorwärts- als auch für Rückwärtsfälle hin, auch wenn Experimente zu unterschiedlichen Zeitpunkten durchgeführt werden. Abbildung 4G zeigt die Lage der Schwerpunkte für die Partitionen. Bei den meisten dieser Partitionen beträgt die Verschiebung der Schwerpunktposition weniger als 18 nm und die Verschiebung der mittleren Ausbreitung beträgt \(58~{\text {nm}}\) (siehe Abb. 4H). Dies ergibt immer noch einen hervorragenden Wert, wenn man bedenkt, dass Moleküle für die sequentielle Datenerfassung bei unterschiedlichen Belichtungszeiten (\(5~{\text {ms}}, ~30~{\text {ms}}, ~50) unabhängig voneinander erkannt und lokalisiert werden ~{\text {ms}}\)). Darüber hinaus weisen relativ kleine Änderungen im Schwerpunkt \(\Delta C\) und der Ausbreitung \(\Delta S\) (paarweise, zwischen 5 und 50 ms; 5 und 30 ms; 30 und 50 ms) auf eine Ähnlichkeit der Partitionen hin (siehe Abb . 4G,H). Insgesamt deutet Abb. 4 auf eine verzerrungsfreie Datenerfassung für Experimente hin, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten und mit unterschiedlichen Belichtungszeiten durchgeführt wurden.

Der unmittelbar nächste Schritt besteht darin, den Clusterbildungsprozess in transfizierten NIH3T3-Zellen zu verstehen, um die HA-Dynamik im Influenza-A-Modell zu verstehen. Wir verwendeten die DBSCAN-Clustering-Technik für die bei \(5~{\text {ms}}\) aufgezeichneten Einzelmoleküldaten und verglichen diese mit Standard-SMLM (\(30~{\text {ms}}\)). DBSCAN verfügt über die besondere Fähigkeit, nur die geclusterten Daten zu berücksichtigen und nicht geclusterte Daten zu übersehen. Hier haben wir einen Grenzwert für den HA-HA-Abstand von \(80~{\text {nm}}\) und ein Minimum von 35 HA-Molekülen zur Clustererkennung gewählt. Die entsprechenden HA-Cluster sind in Abb. 5A–C dargestellt. Obwohl sich die vorgeschlagene Studie auf die Datenerfassung bei kurzer Exposition (\(5~{\text {ms}}\)) konzentriert, haben wir auch Daten bei relativ längerer Exposition erfasst ( \ (\sim 50~{\text {ms}}\)) für Konsistenz. Um sicherzustellen, dass bei allen Belichtungszeiten dieselben Cluster beobachtet werden, ist in Abb. 5D eine Überlagerung der Cluster-Lokalisierungen dargestellt, wobei die Integrationszeit farblich gekennzeichnet ist. Darüber hinaus werden biophysikalische Parameter wie Clusterdichte (1138 mol/μm2), Clusterfläche (0,105 μm2), Anzahl der Moleküle pro Cluster (105) und Clusteranteil oder relatives Clusterfüllverhältnis (\(6,33 \%\) berücksichtigt. pro Zelle) werden ebenfalls ermittelt. Die Parameterwerte stimmen mit der in der Literatur32 berichteten Studie überein. Bei kurzen Belichtungszeiten konnten wir keine wesentliche Änderung dieser Parameter feststellen, insbesondere im Vergleich zum Standard-SMLM. Dies geht aus den Diagrammen in Abb. 5E hervor. Optisch erscheint der Cluster bei allen Belichtungszeiten konsistent. Dies bestätigt die Tatsache, dass Strukturinformationen im Zusammenhang mit HA-Clustern bei kurzen Belichtungszeiten erhalten bleiben.

Um die Auswirkungen einer kurzen Belichtungszeit auf die Bildqualität zu verstehen, haben wir die mittlere Lokalisierungsgenauigkeit berechnet. Es ist ganz offensichtlich, dass die Lokalisierungsgenauigkeit bei kurzer Belichtungszeit leidet. Insbesondere führt eine Verkürzung der Belichtungszeit im Vergleich zum Standard-SMLM zu einer leichten Verringerung der Lokalisierungsgenauigkeit (oder räumlichen Auflösung) von etwa \(11,86~{\text {nm}}\) (entsprechend einer PAR-Verschiebung in Richtung Klassik). Beugungsgrenze, \(\sim \lambda / 2\)). Die Kosten für eine schnelle hochauflösende Bildgebung sind also ein teilweiser Verlust der räumlichen Auflösung (Abb. 6). Dies änderte jedoch nicht wesentlich unsere Analyse der Clusterbildung einzelner Moleküle für das vorgeschlagene Krankheitsmodell (Influenza-A-Modell). Eine detaillierte Studie zu einer anderen Probe wird in Ergänzung 1 und 2 besprochen. Dies weist darauf hin, dass ein Verlust der Lokalisierungsgenauigkeit für die Analyse einzelner Molekülcluster und ihrer Dynamik akzeptabel sein kann, um eine Verbesserung der zeitlichen Auflösung zu erzielen. Dies deutet auch darauf hin, dass es eine Art Unsicherheitsbeziehung zwischen der Lokalisierungsgenauigkeit und der zeitlichen Auflösung gibt, soweit es um die Bildgebung einzelner Moleküle geht.

Um den Vorteil von \(short-SMLM\) für eine hohe zeitliche Auflösung zu untermauern, werden Experimente an lebenden NIH3T3-Zellen durchgeführt. Nach der Transfektion mit dem Dendra2-HA-Plasmid wurden die Zellen über einen langen Zeitraum (ca. 40 Minuten) abgebildet und die Daten werden in 5 Sätze mit einer Dauer von jeweils 8 Minuten aufgeteilt. Für jeden Satz werden etwa 5.000 Bilder gesammelt und 3.000 einzelne Moleküle identifiziert. Anschließend werden für jeden Satz hochaufgelöste Bilder rekonstruiert und die Lokalisierungsgenauigkeit wie in Abb. 7 dargestellt dargestellt. Die Clusteranalyse wird mit dem DBSCAN-Algorithmus durchgeführt und nicht geclusterte Moleküle werden entfernt. Die visuelle Analyse und Überlagerung aller Bilder (nach Zeitpunkten) zeigt zeitliche Veränderungen in HA-Clustern, die sich nach der Transfektion bilden, wie durch blaue Pfeile in Abb. 7 angezeigt. Dies deutet zum ersten Mal auf die dynamische Natur des Clusterbildungsprozesses bei HA hin -Cluster bilden sich und/oder wandern in frühen Stadien einer Virusinfektion in einem zellulären System (Influenza-A-Modell). Das Diagramm der Lokalisierungspräzision gegenüber der Zeit (siehe Abb. 7F) zeigt keine signifikante Änderung der durchschnittlichen Lokalisierungspräzision, was auf das Potenzial von \(Short-SMLM\) für eine längere hochauflösende Bildgebung und die Untersuchung schnell auftretender Ereignisse (hier kollektive Dynamik) hinweist von HA-Molekülen) in einer lebenden Zelle.

Wir demonstrierten die \(kurz-SMLM\)-Technik zur Beschleunigung der hochauflösenden Bildgebung auf Einzelmolekülbasis. Mit der Weiterentwicklung der sCMOS-Kameratechnologie ist es möglich geworden, Daten bei kürzeren Belichtungszeiten zu sammeln; Natürlich darf dieser Wert nicht unter der zeitlichen Auflösungsgrenze der Fluoreszenzmikroskopie liegen18. Aufgrund der Tatsache, dass das Blinken einzelner Moleküle in unterschiedlichen Zeitskalen von einigen wenigen bis zu mehreren zehn Millisekunden erfolgt, kann der Datenerfassungsprozess durch die Erfassung von Bildern in wenigen Millisekunden im Vergleich zum Standard-SMLM1 beschleunigt werden. Dies erfordert den Nachweis schnell blinkender Moleküle. Die Technik eignet sich zur Visualisierung biophysikalischer Prozesse (Clusterbildung, Migration, Bindung und Diffusion auf Einzelmolekülebene). Im Allgemeinen löscht die Datenerfassung bei langer Belichtungszeit (im Standard-SMLM verwendet) Ereignisse (Blinken und Schwankungen) aus, die bei relativ kurzen Belichtungszeiten auftreten. Darüber hinaus kann eine relativ lange Belichtung, die häufig in SMLM verwendet wird, die Position einzelner Molekülcluster, die sich dynamisch ändern, erheblich verfälschen. Eine detaillierte Studie zu den Blinkeigenschaften von Dendra2 mit der Belichtungszeit ist in Ergänzung 3 enthalten.

Hier berichten wir über die Aufzeichnung mit kurzen Datenerfassungszeiten, die 2,76-mal kürzer sind als bei Standard-SMLM. Die Ergebnisse zeigen, dass es eine Verschiebung der Lokalisierungsgenauigkeit (Auflösung) in Richtung der klassischen Beugungsgrenze gibt. Insbesondere wird eine PAR-Verschiebung (in Bezug auf die Lokalisierungsgenauigkeit) von \(11,86~{\text {nm}}\) im Vergleich zu SMLM festgestellt. Allerdings ist die Verschiebung tolerierbar, wenn man die Vorteile einer hohen zeitlichen Auflösung nutzt. Eine weitere Analyse der Verteilung einzelner Moleküle hat ein hohes Maß an Konsistenz bei der Datenerfassung bei kurzer Expositionszeit ergeben. Dies wird weiter durch die geschätzten Parameter wie die Anzahl der Moleküle, die Fläche und die Dichte einzelner Molekülcluster ermittelt. Die Tatsache, dass Schwerpunkt und Verteilungsstreuung vernachlässigbar sind, sagt viel über die Konsistenz und Zuverlässigkeit der Datenerfassung bei kurzen Belichtungszeiten aus.

Um die Clusterbildung in einer lebenden Zelle zu verstehen, die mit Dendra2-HA-Plasmid-DNA (Influenza-A-Krankheitsmodell) transfiziert wurde, wird die DBSCAN-Clustering-Technik eingesetzt. Die Ergebnisse zeigen eine konsistente Clusterbildung für Daten, die bei einer Belichtungszeit von 5 ms bis zu 50 ms erfasst wurden. Darüber hinaus hat DBSCAN die Bestimmung kritischer biophysikalischer Parameter wie Clusterdichte, Clusterfläche, Anzahl der Moleküle pro Cluster und des Clusteranteils in einer Zelle ermöglicht. Die Zeitraffer-Bildgebung wird an einer lebenden transfizierten Zelle durchgeführt, um die zeitliche Dynamik von HA-Clustern zu visualisieren (siehe Abb. 7). Die Ergebnisse zeigen die Bildung und Migration von HA-Clustern im Laufe der Zeit. Diese Parameter stehen in direktem Zusammenhang mit der Infektiositätsrate und dem Krankheitsverlauf in einem Krankheitsmodell (hier Influenza-A)32,44. \(kurz-SMLM\) erleichtert also die Untersuchung der zeitlichen Dynamik viraler Partikel (hier HA-Einzelmoleküle), was der Früherkennung und Therapie einen Schritt näher kommt. Auf einzelmolekularer Ebene bedeutet dies, potenzielle Medikamente zur Zerstörung von HA-Clustern während einer Influenza-A-Infektion einzusetzen. Darüber hinaus haben wir einen Zusammenhang zwischen zeitlicher Auflösung und Lokalisierungsgenauigkeit festgestellt, d. h. eine Erhöhung der zeitlichen Auflösung (kurze Belichtungszeit) führte zu einer proportionalen Abnahme der Lokalisierungsgenauigkeit und umgekehrt. In Anbetracht des Vorteils der zeitlichen Auflösung kann die PAR-Verschiebung (in Richtung Beugungsgrenze) akzeptabel sein, um Einblicke in die schnell ablaufenden Ereignisse in einem zellulären System zu gewinnen.

Eine grundlegende Darstellung der Datenerfassungsprozesse in einem typischen SMLM-Mikroskopiesystem ist in Abb. 1 dargestellt. Die für bestimmte Prozesse erforderliche Zeit ist ebenfalls dargestellt, dh die Belichtungszeit \(t_{exp}\), die Auslesezeit \(t_r\) und die PC-Lese-/Schreibzeit (\(t_{r/w}\)). Insbesondere kann die Frame Transfer Rate (FR) für die sCMOS-Technologie wie folgt ausgedrückt werden:

wobei die Auslesezeit durch \(t_{r/w}=\frac{1}{ N + Dr}\) gegeben ist, wobei N die Anzahl der Pixel (\(\#\) Pixel) und \( D_{r}\) ist die Digitalisierungsrate. Beachten Sie, dass die Bildrate durch Verringern der Belichtungszeit und/oder der Bildgröße erhöht werden kann. In der Praxis bedeutet dies die Identifizierung schnell blinkender Moleküle (Moleküle mit kurzer Lebensdauer), die das Potenzial haben, die Rekonstruktion superaufgelöster Bilder zu beschleunigen.

Ein typisches SMLM wird je nach Bedarf an die Datenerfassung bei geringer Exposition angepasst. Zwei Laser, Aktivierungslaser 405 nm (Oxxius, Frankreich) und Ausleselaser 561 nm (Oxxius, Frankreich), werden mit einem dichroitischen Spiegel kombiniert. Eine Optotune-Linse (EL-10-30-CI-VIS-LD-MV, Edmund Optics) fokussiert kolineare kombinierte Strahlen in die hintere Apertur eines Ölimmersionsobjektivs 1,3NA 100\(\times\)(Olympus) von das umgekehrte Olympus-Mikroskop IX81. Durch Veränderung der Brennweite des Optotune-Objektivs kann das Sichtfeld variiert werden45. Ein dichroitischer Filter, der an einem Filterwürfel angebracht ist, unterscheidet das emittierte Fluoreszenzsignal vom Beleuchtungsstrahl. Das Fluoreszenzsignal wird vom gleichen Objektiv gesammelt und von der Mikroskoptubuslinse fokussiert. Ein zusätzlicher Vergrößerungsfaktor von 2,67X wird durch eine Kombination von zwei Tubuslinsen \(f_{1}\) = 75 mm und \(f_{2}\) = 200 mm vor der Fokussierung auf eine sCMOS-Kamera (Zyla 4.2 plus, Pixelgröße) eingeführt 6,5 μm, Andor). Das Bildgebungssystem hat eine Gesamtvergrößerung von 267. Der Notch-Filtersatz (405 nm und 561 nm Shemrock, USA) wird verwendet, um unerwünschte Signale abzuschneiden. Die Intensität der Aktivierungs- und Beleuchtungsstrahlen kann durch eine Kombination aus Polarisations- und Viertelwellenplatten, die im Pfad jedes Laserstrahls installiert sind, fein gesteuert werden11,12,46. Darüber hinaus ist ein separater optischer Arm (mit einer blauen Lichtquelle (470–490 nm)) in das System integriert, um transfizierte Zellen sichtbar zu machen. Das System kann je nach Bedarf zwischen Fluoreszenz- und Super-Resolution-Modus wechseln, ohne den Probentisch zu stören.

Für das Experiment wurden NIH-3T3-Fibroblastenzellen verwendet, die wir von unserem Mitarbeiter Prof. Upendra Nongthomba (Biological Sciences, Indian Institute of Science, Bangalore, Indien) erhalten hatten. Wir entschieden uns für die Arbeit mit dem Influenza-A-Modell, bei dem NIH-3T3-Fibroblastenzellen vorübergehend mit dem Dendra2-HA-Plasmid transfiziert wurden. Zunächst wurden die Zellen aus konservierten Proben in flüssigem Stickstoff (\(-196 \circ C\)) aufgetaut und auf Wachstumsmedium (90\(\%\)DMEM + 9\(\%\) Kälber-Rinderserum kultiviert + 1\(\%\) Penicillin-Streptomycin). 24 Stunden nach der Kultur wurde ein neues Wachstumsmedium hinzugefügt, nachdem gewaschene 1X phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) verworfen wurde. Die Aussaat erfolgt, sobald die Zellkonfluenz mehr als 80\(\%\)Dichte mit einer Zellzahl von etwa \(10^{5}/{\text {cm}}^{2}\) beträgt. Nach zwei Durchgängen werden die transfizierten Zellen in einer 35-mm-Scheibe (mit Deckglas) gezüchtet. Für die Transfektion werden 80–90\(\%\) des konfluenten Wachstums beibehalten. Wir folgten dem transienten Transfektionsprotokoll Lipofectamine 3000 (Life Technologies, Invitrogen) für die Dendra2HA-Transaktion in NIH3T3-Zellen. Für die Live-Bildgebung wurden die Zellen mit 1X PBS gewaschen und nach 24 Stunden Transfektion wurde Wachstumsmedium hinzugefügt. Für die Bildgebung fixierter Zellen wurden die Zellen jedoch mit 1X PBS gewaschen und mit 3\(\%\) Formaldehyd fixiert und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird nach dem Verwerfen der Flüssigkeiten ein Tropfen Eindeckmedium Fluorsave (Thermofisher Scientific) verwendet und oben auf das rechteckige Deckglas Nr. 0 (BlueStar) gelegt. Die fixierten Zellen wurden dann zur Langzeitkonservierung und Untersuchung mit Nagellack luftdicht verschlossen.

Wir untersuchten Dendra2-Proteine, die mit dem Influenza-Virusprotein Hämagglutinin (Dendra2HA) konjugiert sind, als photoaktivierbares Protein zur Untersuchung der HA-Dynamik in einer transfizierten Zelle. Bei UV-Violett-Bestrahlung (360–420 nm) wechselt das Protein in den rot fluoreszierenden Zustand. Nicht aktiviertes Dendra2HA kann bei Anregungs-Emissionsmaxima bei 480/507 nm sichtbar gemacht werden, während aktiviertes Dendra2HA-Protein Anregungs-/Emissionsmaxima bei 553/573 nm aufweist. Das fluoreszierende Protein Dendra2HA ist der Schlüssel zum Verständnis der Ausbreitung des Influenzavirus in Säugetierzellen (wie NIH3T3-Zellen). Dies wurde mit umstrittenen cholesterinreichen Lipidflößen in Verbindung gebracht. Influenzaviren werden aus Raft-Domänen in der Plasmamembran zusammengesetzt. Die Expression von HA47, die Clustergröße, -anzahl und -dichte sind quantitative Parameter zum Verständnis der Infektion und Freisetzung von Knospen aus infizierten Zellen48. Bestehende Systeme31,49 haben das Vorhandensein von Clustern von HA-Molekülen nur bei langer Einwirkzeit gezeigt. Nach der Photoaktivierung und anschließenden Anregung bei 561 nm und der gewünschten Belichtungszeit wird die Fluoreszenz einzelner Moleküle mithilfe von sCMOS aufgezeichnet. Die Lokalisierungsgenauigkeit wurde mithilfe der Thompson-Relation50 berechnet. Während des Experiments wurde festgestellt, dass das durchschnittliche Hintergrundrauschen \(\sim 27\) Photonen/Pixel beträgt und die durchschnittliche Photonenzahl \(\sim 170\) beträgt. Die Bilder werden mit \(512\times 512\) Pixeln aufgezeichnet und die Bildpixelgröße wird mit 82,15 nm berechnet (für eine Systemvergrößerung von 267X). Darüber hinaus bietet sCMOS den Vorteil einer reduzierten Datenübertragungsrate (\(\sim 10 ~{\text {ms}}\)) im Vergleich zu EMCCD, das eine feste Rate von \(\sim 30~{\text {ms}}\) für ein Erkennungsfenster von \(512 \times 512\) Pixeln. Wir führten die Erfassung bei einer Belichtungszeit von 5 ms, 30 ms und 50 ms mit einem Zeitabstand von 1 Minute zwischen aufeinanderfolgenden Experimenten/Datenaufzeichnungen durch. Es ist anzumerken, dass eine Belichtung von 5 ms im Wesentlichen zu einer effektiven Einzelbildaufnahme (mit der Größe \(1024 \times 1024\) Pixel) von \(15~{\text {ms}}\) (einer Belichtung) führt Zeit von \(5~{\text {ms}}\) und einer Auslesezeit von \(10~{\text {ms}}\) ). Experimentell beträgt die Datenerfassungsgeschwindigkeit (nur unter Berücksichtigung der Belichtungszeit, der Auslesezeit und unter Vernachlässigung der Geschwindigkeit des Schreibens/Lesens von Systemdaten) von belichteten Datensätzen mit 5 ms, 30 ms und 50 ms 66 fps, 25 fps bzw. 15 fps. Wir haben einen Vorwärtsdatensatz erfasst, der eine Schleife von 5 ms-30 ms-50 ms-30 ms-5 ms Belichtungserfassungsdatensatz ist, und der Rückwärtsdatensatz ist eine Schleife von 50 ms-30 ms-5 ms-30 ms -50-ms-Belichtungsdatensatz für die unterschiedliche Zelle mit derselben Kamerakonfiguration (siehe Ergänzung 4). Insgesamt haben wir für die Studie insgesamt 5 Datensätze erfasst. Während des gesamten Datenerfassungsprozesses wird ein Pixel-Binning von 2 \(\times\) 2 verwendet. Pixel-Binning-Techniken kombinieren die mehreren Pixel zu einem einzigen Pixel, wodurch die belichtete Fläche größer wird und mehr Photonen gesammelt werden, wobei das Ausleserauschen reduziert wird, obwohl die Belichtungszeit kurz ist. Die Datenerfassung erfolgt über die Andor Solis-Plattform, die Daten direkt auf die im PC-System installierte SSD schreibt. Der gesamte erfasste Datensatz wird als Stapel im 16-Bit-.tif-Format gespeichert. Die verwendete Laserleistung: 561 nm beträgt 49 mW und 405 nm 5 μW. Bei der 5-ms-Belichtungsdatenerfassung wurde die Leistung von 405-nm- und 561-nm-Lasern bei 6 μW bzw. \(20~{\text {mW}}\) gehalten (siehe Ergänzung 5).

Einzelne Moleküle werden aus den aufgezeichneten Daten nach einer standardmäßigen Nachbearbeitung gezählt, die eine Hintergrundsubtraktion von den Rohdaten und eine Schwellenwertbildung umfasst32,51,52,53. Konkret wird der Hintergrund dynamisch aus den Rohdaten selbst geschätzt, und wir haben einen Schwellenwert gewählt, der dem Fünffachen des Hintergrunds entspricht. Die Zählmethode betrachtet spärliche Fluoreszenzausbrüche innerhalb der charakteristischen Blinkperiode als eine Molekülzählung, wobei wiederholte Molekülzählungen zu einer verdichtet werden32,53.

Jeder 16-Bit-.tif-Frame wird zunächst anhand des Photonen-zu-Pixel-Verhältnisses in eine Photonenzahl umgewandelt. Das Photonen-zu-Pixel-Verhältnis ist das Maß für die Steigung der Varianz gegenüber der mittleren Intensität50. Die Einzelmolekülrekonstruktion der einzelnen Moleküle erfolgt mithilfe des Einzelcodes auf matlab2021b1,10,11. Die Rekonstruktion folgt den Standardschritten. Der erste Schritt des Prozesses ist die Hintergrundsubtraktion mithilfe des Rolling-Ball-Algorithmus54. Die Hintergrundsubtraktion ist wichtig, da sie nicht zur Bestimmung der Emitterposition beiträgt, sondern zum Signal addiert und dadurch das SNR verringert. Nach der Hintergrundsubtraktion erfolgt die Identifizierung des wahrscheinlichen Moleküls anhand eines Intensitätsschwellenwerts. Dieser Prozess besteht darin, im gegebenen Rahmen nach wahrscheinlichen Molekülen zu suchen, die größer als der Schwellenwert (T1) sind. Alle Pixelwerte über T1 werden tabellarisch aufgeführt. Ein Fenster von zwischen 3 \(\times\) 3 Pixeln und 7 \(\times\) 7 Pixeln mit hoher Intensität als Ursprung, wobei mindestens drei Pixel einen Intensitätswert haben, der größer als der Mindestschwellenwert ist, wird nach dem Schwellenwert zur Bestimmung der Koordinaten passiert und Intensität darin. Für jede Objekterkennung liefert die jeweilige Schwerpunktberechnung die anfänglichen Schätzkoordinaten für die Gaußsche Anpassung.

Dabei gibt die Amplitude der Gaußschen Anpassung die Anzahl der von diesem Molekül detektierten Photonen an. Alle Moleküle sind gleich groß und die Intensität wird durch die Anzahl der Photonen bestimmt.

Die in der Studie verwendeten Rohdaten sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Hess, ST, Girirajan, TP & Mason, MD Ultrahochauflösende Bildgebung durch Fluoreszenz-Photoaktivierungs-Lokalisierungsmikroskopie. Biophys. J . 91(11), 4258–4272 (2006).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rust, MJ, Bates, M. & Zhuang, X. Bildgebung unterhalb der Beugungsgrenze durch stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (STORM). Nat. Methoden 3(10), 793 (2006).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Betzig, E. et al. Abbildung intrazellulärer fluoreszierender Proteine ​​mit Nanometerauflösung. Science 313(5793), 1642–1645 (2006).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Zanacchi, FC et al. Hochauflösende 3D-Bildgebung mit lebenden Zellen in dicken Proben. Nat. Methoden 8, 1047 (2011).

Artikel CAS Google Scholar

Balzarotti, F. et al. Bildgebung und Verfolgung fluoreszierender Moleküle mit Nanometerauflösung und minimalen Photonenflüssen. Wissenschaft 355, 606–612 (2017).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Cnossen, J. et al. Lokalisierungsmikroskopie mit doppelter Präzision und strukturierter Beleuchtung. Nat. Methoden 17, 59–63 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Heilemann, M. et al. Subbeugungsauflösende Fluoreszenzbildgebung mit herkömmlichen Fluoreszenzsonden. Angew. Chem. Int. Ed. 47, 6172–6176 (2008).

Artikel CAS Google Scholar

Dertinger, T., Colyer, R., Iyer, G., Weiss, S. & Enderlein, J. Schnelle hintergrundfreie 3D-Superauflösungs-Bildgebung optischer Fluktuationen (SOFI). Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 106, 22287–22292 (2009).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lusheng, G. et al. Axiale Lokalisierung im molekularen Maßstab durch wiederholte optische selektive Belichtung. Nat. Methoden 18, 369–373 (2021).

Artikel Google Scholar

Partha, P. Mondal, SMILE-Mikroskopie (Simultane Multiplane Imaging-based Localization Encoded) für hochauflösende Volumenbildgebung. Mikrosk. Res. Technik. 80(4), 333–337 (2017).

Artikel Google Scholar

Mondal, PP & Hess, ST Mehrebenen-Lokalisierungsmikroskopie auf Basis der Totalreflexionsfluoreszenz ermöglicht hochauflösende Volumenbildgebung Appl. Physik. Lette. 110, 211102 (2017).

Google Scholar

Partha, P. Mondal, probabilistische, optisch selektive, auf der Lokalisierung kodierte (MÖGLICHE) Mikroskopie einzelner Moleküle für die ultrahochauflösende Bildgebung. PLoS ONE 15(11), e0242452 (2020).

Artikel Google Scholar

Van de Linde, S. et al. Direkte stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie mit Standard-Fluoreszenzsonden. Nat. Protokolle 6(7), 991 (2011).

Artikel PubMed Google Scholar

Fölling, J. et al. Fluoreszenznanoskopie durch Grundzustandsverarmung und Einzelmolekülrückkehr. Nat. Methoden 5(11), 943 (2008).

Artikel PubMed Google Scholar

Henriques, R. et al. QuickPALM: 3D-Echtzeit-Photoaktivierungs-Nanoskopie-Bildverarbeitung in ImageJ. Nat. Methoden 7(5), 339 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sharonov, A. & Hochstrasser, RM Weitfeld-Subbeugungsbildgebung durch akkumulierte Bindung diffundierender Sonden. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 103(50), 18911–18916 (2006).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dong, B. et al. Hochauflösende spektroskopische Mikroskopie mittels Photonenlokalisierung. Nat. Komm. 7, 12290 (2016).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Partha, P. Mondal, zeitliche Auflösung in der Fluoreszenzbildgebung. Vorderseite. Mol. Biowissenschaften. 1, 11 (2014).

Google Scholar

Lin, Y. et al. Quantifizierung und Optimierung der Einzelmolekül-Schaltnanoskopie bei hohen Geschwindigkeiten. PLoS ONE 10, e0128135 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Laplante, C. et al. Hochgeschwindigkeits-Superauflösungsbildgebung lebender Spalthefezellen. Methoden Mol. Biol. 1369, 45–57 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Diekmann, R. et al. Optimierung der Bildgebungsgeschwindigkeit und Anregungsintensität für die Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie. Nat. Meth. 17, 909–912 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Steinhauer, C. et al. Hochauflösende Mikroskopie auf Basis künstlicher Dunkelzustände. Marmelade. Chem. Soc. 130, 16840–16841 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Huang, Z.-L. et al. Lokalisierungsbasierte hochauflösende Mikroskopie mit einer sCMOS-Kamera. Opt. Exp. 19, 19156–19168 (2011).

Artikel Google Scholar

Yuan, Y. et al. Eine schnelle Einzelbild-Superauflösungsmethode, implementiert mit CUDA. J. Echtzeitbild. Proz. 16, 81–97 (2019).

Artikel Google Scholar

Gui, D. et al. Beschleunigung der Multi-Emitter-Lokalisierung in der hochauflösenden Lokalisierungsmikroskopie mit kooperativer FPGA-GPU-Berechnung. Opt. Express 29(22), 35247–35260 (2021).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Munro, I. et al. Beschleunigung der Lokalisierungsmikroskopie einzelner Moleküle durch Parallelverarbeitung auf einem Hochleistungs-Rechnercluster. J. Microsc. 273(2), 148–160 (2019).

Artikel MathSciNet CAS PubMed Google Scholar

Jones, SA et al. Schnelle, dreidimensionale hochauflösende Bildgebung lebender Zellen. Nat. Methoden 8(6), 499 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Avilov, S. et al. In-Cellulose-Bewertung der Phototransformationsquantenausbeuten in fluoreszierenden Proteinen, die als Marker für die Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie verwendet werden. PLoS ONE 9, e98362 (2014).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Holden, SJ, Uphoff, S. & Kapanidis, AN DAOSTORM: Ein Algorithmus für hochauflösende Mikroskopie mit hoher Dichte. Nat. Methoden 8(4), 279 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zhu, L. et al. Schnelleres STORM mit Compressed Sensing. Nat. Methoden 9(7), 721 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gudheti, MV et al. Aktin vermittelt die nanoskalige Membranorganisation des Clustermembranproteins Influenza-Hämagglutinin. Biophys. J. 104, 2182–2192 (2013).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Curthoys, NM et al. Influenza-Hämagglutinin moduliert die Membranclusterung von Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat. Biophys. J. 116, 893–909 (2019).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Joshi, P. & Mondal, PP Einzelmolekül-Clustering für hochauflösende optische Fluoreszenzmikroskopie. Photonik 9, 7 (2021).

Artikel Google Scholar

Boyd, N. et al. DeepLoco: Schnelle 3D-Lokalisierungsmikroskopie mithilfe neuronaler Netze. (2018).

Zelger, P. et al. Dreidimensionale Lokalisierungsmikroskopie mittels Deep Learning. Opt. Express 26(25), 33166–33179 (2018).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Diekmann, R. et al. Charakterisierung einer CMOS-Kamera in Industriequalität, die sich gut für die Lokalisierungsmikroskopie einzelner Moleküle eignet – leistungsstarke Superauflösung zu niedrigen Kosten. Wissenschaft. Rep. 7, 14425 (2017).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shim, SH et al. Hochauflösende Fluoreszenzbildgebung von Organellen in lebenden Zellen mit photoschaltbaren Membransonden. PNAS 109, 13978–13983 (2012).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Solovyev, ID et al. Monomerisierung des photokonvertierbaren Fluoreszenzproteins SAASoti durch rationale Mutagenese einzelner Aminosäuren. Wissenschaft. Rep. 8, 15542 (2018).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, Z. et al. 3D-Bildgebung von Sox2-Enhancer-Clustern in embryonalen Stammzellen. Elife 3, e04236 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Casse, F. & Martin, S. Verfolgung der aktivitätsabhängigen Diffusion synaptischer Proteine ​​mithilfe der eingeschränkten Photokonvertierung von Dendra2. Vorderseite. Zelle. Neurosci. 9, 367 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Van Heel, M., Keegstra, W., Schutter, W. & Van Bruggen, E.J.F. Hämocyaninstrukturen von Arthropoden, untersucht durch Bildanalyse. Lebenschemie. Rep. Zus. 1, 69–73 (1982).

Google Scholar

Tortarolo, G., Castello, M., Diaspro, A., Koho, S. & Vicidomini, G. Zwei-Photonen-Bild-Rastermikroskopie mit SPAD-Array und blinder Bildrekonstruktion. Optica 5, 32–35 (2018).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Debelee, TG, Schwenker, F., Rahimeto, S. & Yohannes, D. Bewertung eines modifizierten adaptiven k-means-Segmentierungsalgorithmus. Berechnen. Vis. Med. 5, 347–361 (2019).

Artikel Google Scholar

Hess, ST Die dynamische Clusterverteilung von Hämagglutinin, aufgelöst bei 40 nm in lebenden Zellmembranen, unterscheidet zwischen Raft-Theorien. PNAS 104, 17370–17375 (2007).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Joshi, P., Aravinth, M. & Partha, P. Adaptierbare Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie (aSMLM) für hochauflösende optische Fluoreszenzbildgebung. Appl. Physik. Lette. 119, 173703 (2021).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Mondal, Partha P., Curthoys, Nikki M. & Hess, Samuel T. Superauflösende Mikroskopie mit sauberer Lokalisierung für die biologische 3D-Bildgebung. AIP Adv. 6, 015017 (2016).

Artikel ADS Google Scholar

White, J., Helenius, A. & Gething, MJ Hämagglutinin des Influenzavirus, exprimiert von einem geklonten Gen, fördert die Membranfusion. Nature 300, 658–659 (1982).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Chen, BJ, Leser, GP, Morita, E. & Lamb, RA Influenzavirus-Hämagglutinin und Neuraminidase, jedoch nicht das Matrixprotein, sind für den Zusammenbau und die Knospung von aus Plasmiden stammenden virusähnlichen Partikeln erforderlich. J. Virol. 81, 7111–7123 (2007).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hess, ST et al. Die dynamische Clusterverteilung von Hämagglutinin, aufgelöst bei 40 nm, in lebenden Zellmembranen unterscheidet zwischen Raft-Theorien. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 104, 17370–17375 (2007).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Thompson, RE, Larson, DR & Webb, WW Präzise Nanometer-Lokalisierungsanalyse für einzelne Fluoreszenzsonden. Biophys. J . 82, 2775–2783 (2002).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hummer, G. Franziska Fricke und Mike Heilemann, Modellunabhängige Zählung von Molekülen in der Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie. Mol. Biol. Zelle 27, 3637–3644 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Greenfield, D. et al. Selbstorganisation des Chemotaxis-Netzwerks von Escherichia coli, abgebildet mit hochauflösender Lichtmikroskopie. PLoS Biol. 7, e1000137 (2009).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Lee, SH, Shin, JY, Lee, A. & Bustamante, C. Zählung einzelner photoaktivierbarer fluoreszierender Moleküle durch photoaktivierte Lokalisierungsmikroskopie (PALM). Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 109, 17436–17441 (2012).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sternberg, SR Biomedizinische Bildverarbeitung. IEEE Comput. 16, 22–34 (1983).

Artikel Google Scholar

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Instrumentierung und angewandte Physik, Indian Institute of Science, Bangalore, Indien

Jigmi Basumatary, Neptun Baro und Partha Pratim Mondal

Fakultät für Physik, Universität Pisa, Pisa, Italien

Mädchen Cella Zanacchi

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Alle Autoren haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen.

Korrespondenz mit Fancesca Cella Zanacchi oder Partha Pratim Mondal.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Ergänzende Informationen 2.

Ergänzende Informationen 3.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Basumatary, J., Baro, N., Zanacchi, FC et al. Zeitlich aufgelöstes SMLM (mit großer PAR-Verschiebung) ermöglichte die Visualisierung der dynamischen HA-Clusterbildung und -Migration in einer lebenden Zelle. Sci Rep 13, 12561 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39096-4

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Eingegangen: 19. Januar 2023

Angenommen: 20. Juli 2023

Veröffentlicht: 02. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39096-4

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